로 불후의 손쥐 뇌 Microvascular 내피 세포 라인의 생성<em> 체외에서</em> 혈액 뇌 장벽 모델

1. 뇌 Microvessels의 절연 각 준비 중 여성의 5-10 신생아 마우스 (3-5일 이전)을 사용합니다. 지역 IACUC / 수의사 추천에 따라 마우스를 안락사시켜야 즉시 뇌를 제거하고 다음과 같은 솔루션을 포함하는 페트리 접시에 전송 : 15 밀리미터 Hepes (산도 7.4), 153 MM NaCl, 5.6 MM KCl, 2.3 MM CaCl 2 X 2H 2 O, 2.6 MM MgCl 2 X 6H 2 O, 1 % (w / V) BSA (이하와 같은 A를 버퍼링 참조). 특별히 명시하지 않는 한, 모든 절연 절차는 층류의 후드 아래에 실내 온도 (RT) (22-24 ° C)에서 수행해야합니다. 버퍼에, meninges 및 모세관 조각을 제거 후, ​​머리를 (소뇌와 뇌간이없는 꿈) 잘라 멸균 메스를 사용하여. 조직가 조각 피펫 아래로 더 clumps가 나타나지 때까지 10 ML의 피펫을 사용합니다. RT에서 5 분 250 XG에서 50 ML 팔콘 튜브와 원심 분리기에 정지 전송합니다. 참고 : Meninges는 뇌 세포의 표면에 얇은 투명 멤브레인으로 식별 할 수 있습니다. 그들은 조심스럽게 무균 집게로 제거 할 수 있습니다. 표면에 뜨는 폐기하십시오. 4.5 ML 버퍼에있는 펠릿을 분해 0.75 %의 1.5 ML (w / V)와 collagenase / dispase (로슈)와 37 번 45 분 ° 물 욕조에서 C (가끔 흔들어)에 품다. 한편, 콜라겐 IV (0.1 밀리그램 / 50 MM 아세트산에 용해 ML)로 코팅 네 우물을하여 12 잘 접시를 준비합니다. 1 시간에 준수 할 수 있습니다. 15 ML 얼음처럼 차가운 버퍼 A. Resuspend 철저하게 펠릿의 추가하여 소화를 중지합니다. RT에서 10 분 250 XG에서 정지 원심 분리기. 표면에 뜨는 폐기하십시오. myelin을 제거하려면, 4 ° C.에 20 분 1,000 XG에서 10 ML 25% (w / V) BSA (시그마, 순도> 98%)와 원심 분리기를 추가 25 % BSA는 1X PBS (PAA Laboratories의)에 용해 및 0.2 μm의 F를 통해 필터링해야합니다ilter). 표면에 뜨는을주의 깊게을 삭제, 10 ML 버퍼에있는 펠릿을 분해하고 새로운 팔콘 튜브에 전송할 수 있습니다. RT에서 5 분 250 XG에서 정지 원심 분리기. 그 결과 펠렛은 내피 세포가 포함되어 있습니다. PBS로 두 번 콜라겐 IV-코팅 12도 판을 씻으십시오. 이 우물, 각도 2 ML에 4 성장 매체의 ML (DMEM 10 % FCS, 50U/ml 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % L-글루타민을 포함)와 플레이트 세포 현탁액에서 펠렛을 Resuspend. 37 번 45 분 4 μg / ML 및 배양의 최종 농도 ° 세포 문화 인큐베이터에서 C로 puromycin을 추가합니다. 이 단계는 급속하게 준수 세포의 제거를 할 수 있습니다. 참고 : Puromycin는 24 시간에 추가됩니다. 만 뇌 ECS는 다른 세포 유형에 puromycin 14 독성이며,이를 흡수 할 수 있습니다. 이 새로운 우물 (이 우물은 EC 분획을 포함)에 단계 1.14에서 비 준수 세포를 포함하는 2 ML 매체를 전송합니다. STE의 준수 세포로 우물을 작성P 2 ML 신선한 매체 (이 우물은 다른 세포 유형, 예를 들어 섬유 아세포, astrocytes을 포함하고 병렬로 성장하고 형태의 비교에 사용할 수 있습니다)에 1.14. 다음 날 매체를 변경합니다. 2. 브레인 Microvascular 내피 세포를 Immortalizing GP + E-86 네오 (GPENeo) 15 섬유 아세포, 분비 10% 열 inactivated FCS, 50U/ml 페니실린 / 스트렙토 마이신, 2 MG / ML G418을 (포함 DMEM 매체에 polyoma 중 T의 종양 유전자와 복제 – 결함 바이러스를 배양 . 젤라틴 코팅 플라스크에 PAA Laboratories의) 참고 : Polyoma 중 T의 종양 유전자의 transfection은 4~6주 문화의 내피 형태로 세포의 동질적인 monolayer로 이어지는 비 ECS를 통해 ECS의 성장 우위가 발생합니다. GPENeo가 상업적으로 사용할 수 없으며 (원본 출판물에 4,16을 참조하시기 바랍니다) 공유 공공 소재로 얻을 수 있습니다. 에 대한 바이러스 함유 미디어를 사용하려면 불멸화, 24 H에 G418 무료 매체에 GPENeo 세포를 배양. GPEneo 표면에 뜨는 10 ML을 제거 및 8 μg / ML의 최종 농도에 Polybrene (hexadimethrine 브롬화) (시그마)를 추가, 세포 파편을 제거하는 필터 0.45 μm을 통해 소독. 1 부에서 준비 EC 문화에서 성장 매체를 제거하고 우​​물에 GPEneo 표면에 뜨는 / Polybrene 혼합물의 2 ML를 추가합니다. 신선한 GPEneo Polybrene / 표면에 뜨는 혼합물을 사용하여 다음 날을 반복 참고 :. Polybrene는 바이러스 입자)으로 감염을 촉진하기 셀 벽에 구멍을하는 데 사용됩니다. GPEneo 표면에 뜨는 / Polybrene 혼합에게 다음 날 제거 PBS로 두 번 세포를 씻고 그것에게 매 3 일마다 변경의 성장 매체에있는 세포를 유지하고 있습니다. 합류 후, 콜라겐 IV – 코팅 접시에 세포에게 1시 2분을 분할. 일반적으로, 안정적 뇌성 내피 (cEND) 셀 라인 4~5주 나중에 취득해야합니다. E "> 3. 뇌 Microvascular 내피 세포 육성 10 ML 미리 예열 매체 15 ML-팔콘의 물을 욕조 및 전송에 cryoaliquot에서 세포를 해동. RT에서 5 분 250 XG에서 정지 원심 분리기. 매체를 제거합니다 (도금에 대한 세포 밀도가 적어도 1 회 10 4 셀 / ML이어야 함) 사전 예열 성장 매체와 콜라겐 IV 코팅 T 25cm 2 세포 배양 플라스크에서 펠렛을 전송합니다. 다음 날 매체를 변경하고 세포가 합류에 도달 한 후 (보통 후 5 일) 셀을 분할. 4. cEND – 세포의 분리 (참고 : 분할 만 일주일에 한 번씩 수행 할 경우, 1시 4분보다 높은 분리하지 마십시오). , 중간을 제거 PBS로 세포를 씻어. 37 품다 따뜻한 트립신 – EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션 (PAA Laboratories의) (T 75cm 2 플라스크), 3 ML을 추가 ° C 및 셀 레이어가 (보통 5-15 분 이내) 분산 될 때까지 기다리십시오. 5 ML O를 추가합니다F 성장 매체는 최대 피펫 아래로, 그리고 IV-코팅 플라스크 새로운 콜라겐으로 전송됩니다. 5. cEND – 세포의 동결 4 단계에서 설명 된대로 세포 현탁액을 확보 RT에서 5 분 250 XG에서 정지 원심 분리기. 6 ML 냉동 매체 (95 % 성장 매체, 5 % DMSO)에 세포 펠릿 (1 T 75cm 2 플라스크로부터 얻은) Resuspend. . 한 cryo-나누어지는이 T 25cm 2 플라스크에 놓는 할 수 있습니다 : 네 개의 1.5 ML cryo-aliquots 참고로 세포 현탁액을 나눈다. 액체 질소 증기 온도에서 cryo-aliquots를 저장합니다. 450 ML DMEM, 10 % FCS, 10 ML L-글루타민, 2% 가상 – 키트, 2퍼센트 NEAA, 10 ML의 나트륨의 pyruvate, 50 U / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신 : 성장 매체를 cEND 6. 대표 결과 cEND 및 cerebEND 세포가 내피의 immunostainings을 특징으로 한차 BBB는 transendothelial 전기 저항 (티에르)와 투자율의 측정에 의해뿐만 아니라 마커. cEND과 cerebEND이 합류에서 성장 억제를 전시 단단히 포장 길쭉한 세포 monolayers과 뇌 ECS의 주요 문화와 비슷한 형태했다. 세포는 immunofluorescence (그림 3) 4,5으로 표시된 셀 셀 접합에서 지역화 된 claudin-5, occludin 및 VE-cadherin 단백질 잘 감지 레벨을 표명했다. 혈청 – 감소 미디어에서 배양의 cEND 전지는 티에르의 증가 (Ωcm 2 150 2퍼센트 혈청의 존재 500 Ωcm 2 혈청 10 %의 존재에서) 하이드로 코티손의 추가에 의해 potentiated되었습니다 (800 Ωcm으로 이어 2) 혹은 인슐린 (1,000 Ωcm 2) 4. 21일에 대한 혈청 – 할인 매체에 배양 cEND의 Monolayers이있어서 900 Ωcm 2 (그림 4)의 티에르. 티에르는 어셈블리를 사용하여 측정되었다포함하는 전류 전달 및 전압 측정 전극 (세계 정밀 계측기). 비교를 들어, 1 차 microvascular 뇌 ECS는 Ωcm 2, 상업적으로 이용 가능한 마우스 세포주 bEnd.3는 스님 2005 년과 토스 동부 표준시를 참조 최근 검토 100-140 Ωcm 2 (중 티에르 값을 가지고 200-600의 티에르 값을 가지고보고되었습니다 알., 2011 년 17,18). 또한, 4 시간 이상 같은 비 충전 분자 질량 4, 10, 70, 500 kDa의 FITC-dextrans, 또는 2퍼센트 FCS 차별화 매체에 cEND의 monolayer에서 fluorescein (300 다)와 같은 고분자의 통로가 감소되었다 10% FCS를 포함하는 성장 매체에 유지 관리 전지와 비교 : paracellular 플럭스는 FITC-dextrans 10 70 kDa에 26%까지 fluorescein의 제어 세포의 30 %로 축소되었고, 플럭스는 FITC에 대한 제어 세포의 4.5 %로 감소되었다 – dextrtan 500 kDa. 값을 티에르와 마찬가지로 투자율은 gluc의 면전에서 배양 세포에서 낮은 수준에 있었어요ocorticoids (GC) 4. 더 연구에서, 우리는 글루코 코르티코이드 대상 유전자, occludin, claudin-5 및 뇌 혈관 내피 4,7,9에서 VE-cadherin을 확인. GC 치료는 이러한 단백질의 표현의 증가와 세포 골격에 대한 VE-cadherin의 다시 정리하기로 하였다. 꼭 접합 단백질 occludin과 claudin-5의 직접 GC로 인한 규정은 발기인 지역 4,7,19에서 GC 응답 요소를 통해 나타납니다. 또한, claudin-5는 혈관 내피 10 소설 에스트로겐 대상으로 확인되었다. 내피 부전 underlies 여러 가지 질병을. 우리는 산소 / 포도당 박탈 (OGD) 조건 하에서 cEND을 배양. OGD는 GC와 proteasome 억제제를 bortezomib 12 결합 치료 후 재구성 할 수있는 BBB 기능의 중단에되었다. OGD 조건은 포도당 통풍 관에서 강한 인상을 이끌어 포도당 transpor의 표현에MK801, NMDA 수용체 – 13 비 경쟁적 억제제를 추가로 감소 될 수 cerebEND의 감마선. 1 그림. 뇌 microvascular 내피 세포 (cEND) 절연을 차례로 일주일 정도. 가벼운 현미경 사진의 형태는 6x (A)와 15x (B) 확대에 따라 촬영 된 것입니다. 내피 세포의 섬 형성 식민지가 표시됩니다. 그림 2. 절연 및 불멸화 후 뇌 microvascular 내피 세포 (cEND)의 형태 일개월. 가벼운 현미경 사진은 15x 배율에서 촬영 된 것입니다. 합류, 동질적인 내피 세포 monolayer를 볼 수 있습니다. 그림 3. 불후의 뇌 microvasculAR 내피 세포 특급 claudin-5, occludin 및 VE-cadherin. CEND 세포는 콜라겐 IV-코팅 coverslips에 성장과 claudin-5에 대한 항체 (A), occludin (B)와 VE-cadherin (C) 물들되었습니다. 이미지는 40x 확대에 따라 Zeiss Axioscop2 현미경을 사용하여 촬영 된 것입니다. 4 그림. cEND monolayer. CEND의 transendothelial 전기 저항 측정 (티에르)는 콜라겐 IV-코팅 transwell 필터 (기공 크기 0.4 μm)에서 성장했다. 합류에 도달 한 후 셀 2% FCS를 포함하는 매체에 유지되었다. 티에르는 전류 전달 및 전압 측정 전극을 포함하는 어셈블리를 사용하여 7, 14, 21 일 후에 측정되었다.