Kwantitatieve Fitness Analyse (QFA) is een complementaire reeks van experimentele en computationele methoden voor het schatten van microbiële cultuur fitnesses. QFA schat het effect van genetische mutaties, drugs of andere toegepaste behandelingen microbe groei. Experimenten scaling van gerichte analyse van de afzonderlijke culturen tot duizenden parallelle culturen kan worden ontworpen.
Kwantitatieve Fitness Analyse (QFA) is een experimentele en computationele workflow voor het vergelijken van fitnesses van microbiële culturen gekweekt in parallel 1,2,3,4. QFA kan worden toegepast op gerichte waarnemingen van enkele culturen, maar is vooral handig voor genoom-brede genetische interactie of drugs schermen onderzoeken tot duizenden onafhankelijke culturen. De centrale experimentele methode is de inenting van onafhankelijke, verdunde vloeibare microbiële culturen op vaste agar platen die worden geïncubeerd en regelmatig gefotografeerd. Foto van elk tijdstip van levensbeëindiging geanalyseerd, van kwantitatieve celdichtheid schattingen, die worden gebruikt om groeicurves bouwen, waardoor kwantitatieve geschiktheid maatregelen worden afgeleid. Cultuur fitnesses kan vergeleken worden met te kwantificeren en te rangschikken genetische interactie sterke of overgevoeligheid voor medicijnen. Het effect op de cultuur geschiktheid van eventuele behandelingen toegevoegd in de ondergrond agar (bijvoorbeeld kleine moleculen, antibiotica of voedingsstoffen) of toegepast op platen externely (bijvoorbeeld UV-straling, temperatuur) kan worden gekwantificeerd door QFA.
De QFA workflow produceert groei schat analoog aan die verkregen door spectrofotometrische meting van parallelle vloeibare culturen in 96-wells of 200-wells plaat lezers. Belangrijk QFA heeft aanzienlijk hogere doorvoer vergeleken met deze methoden. QFA culturen groeien op een stevige agaroppervlak en daardoor goed belucht tijdens de groei zonder roeren of schudden.
QFA doorvoer is niet zo hoog als die van sommige synthetische Genetische Array (SGA) screeningsmethoden 5,6. Echter, aangezien QFA culturen zijn sterk verdund alvorens te worden ingeënt op agar, kan QFA vastleggen completer groeicurves, met inbegrip van exponentiële en verzadiging fase 3. Bijvoorbeeld groeicurve waarnemingen kunnen cultuur verdubbelingstijden rechtstreeks worden bepaald met hoge precisie, zoals eerder besproken 1.
Hier presenteren wij eenspecifieke QFA protocol toegepast op duizenden S. cerevisiae culturen die automatisch door robots behandeld tijdens de inoculatie, incubatie en beeldvorming. Elk van deze automatische stappen kunnen worden vervangen door een equivalente, handmatig procedure met een bijbehorende afname van de doorvoer en ook een geringer throughput hand protocol. Dezelfde QFA software tools kunnen worden toegepast op beelden die zijn vastgelegd in een van beide workflow.
We hebben uitgebreide ervaring toe te passen QFA aan culturen van de gist S. cerevisiae, maar we verwachten dat QFA zal blijken ook nuttig voor de behandeling van culturen van de kernsplijting gist S. pombe en bacteriële culturen.
QFA is in vele opzichten een directe afstammeling van drie gevestigde bench-schaal microbiologische technieken: cultuur verdunningsreeks ter plekke testen 9, groeicurve bepaling in beluchte vloeistof, culturen 9 en replica plating 13. Deze drie methoden worden samengevat en vergeleken met QFA en high-throughput technieken in tabel 2. Overwegende dat de verdunningsreeks plek testen van een stam van de fitness te definiëren als het vermogen om kolonies in een reeks van culturen uitgegroeid van een scala aan inoculum verdunningen te vormen, om QFA maatregelen stam fitness door herhaalde waarnemingen van een enkele cultuur de bouw van een groeicurve. Het kwantificeren van fitness van een enkele cultuur kunnen veel meer stammen tegelijk worden onderzocht, onder identieke omstandigheden. Repliceren arrays van culturen maakt herhaalde testen van stam collecties, het meest nuttig bij het testen voor cultuur fitness verschillen in de verschillende omgevingen of genetische achtergronden. De QFA protocol gepresenteerdhier maakt gebruik van dure robot apparatuur te vermenigvuldigen, te enten, incubeer en beeld agar platen, geschikt voor het observeren van de groei van duizenden onafhankelijke culturen (robot QFA, tabel 2). Aangezien QFA gebaseerd op vaste, traditionele laboratoriumtechnieken kan ook worden uitgevoerd veel goedkoper te vervangen door robot bijstand handmatige stappen (handmatige QFA tabel 2). Handmatig QFA gaat replicatie en enten van culturen op agar platen met behulp van een handleiding pin gereedschap en handmatige overdracht van platen van en naar een incubator voor de fotografie. Dezelfde computationele analyse workflow kan worden toegepast om de groei curves van zowel experimenteel ontwerp te genereren.
QFA fitness schattingen lijken relatief precies te zijn. In figuur 4 zijn de gemiddelde fitnesses vier clusters voorbeeld van functioneel verwante gendeleties gemarkeerd. De nabijheid van de leden van elke functioneel verwante gen klasse in twee onafhankelijkENT genetische achtergronden (ura3Δ en cdc13-1) geeft de reproduceerbaarheid van QFA fitness schattingen. Bijvoorbeeld, op slechts 3 gendeleties (op een totaal van 4300) te scheiden van de drie leden van de geconserveerde MRX complex.
High-throughput alternatieven QFA voor het testen groeikarakteristieken van bacteriestammen omvatten SGA 5,6 concurrentie schermen barcode bibliotheken 11,12 en schermen vastleggen extinctie kinetiek spectrofotometrische plaat lezer 10 zijn samengevat in tabel 2 nader beschreven elders 8 . QFA en SGA platen, waar culturen groeien op vaste agar oppervlakken (agar based methoden, tabel 2) kunnen snel en eenvoudig worden verholpen door robot. Solid agar oppervlak culturen zijn goed belucht in de groei en de cellen kunnen groeien in vaste culturen, waardoor gezellige microben om te groeien in een gemeenschap 14. Intact gelaten, microbiële gemeenschappen eenffect eigen micro-omgevingen afscheidende toxinen zoals ethanol, en eventueel signalering tussen cellen. Echter, continu mengen van vloeibare culturen, die nodig zijn om voldoende beluchting te bereiken, kunstmatig verstoort microbiële gemeenschappen en hun micro-omgeving die van invloed kunnen hun manieren van groei. Kruisbesmetting is minder groot probleem in vaste agar methode, omdat er minder kans op spatten de uitvoering cellen tussen culturen. Mocht contaminatie optreden door buitenlandse lucht verspreide micro-organismen in vaste agar testen, kan het vaak worden gedetecteerd door visuele inspectie van vaste agarplaten en verantwoord of verwijderd.
QFA doorvoer aanzienlijk hoger dan parallel vloeistof methoden op twee manieren. In de eerste plaats op de QFA (en SGA) platen, geënt culturen elkaar gepakt dichter, waardoor meer onafhankelijke culturen per plaat. In QFA zijn er doorgaans 308 culturen, niet meegerekend niet-experimentele edge culturen (figuur 1) comVergeleken met vloeibare kweken parallel met 96 of 100 culturen per plaat. Ten tweede kan QFA experimenten worden geschaald met een veel groter aantal platen. Hoewel het aantal platen geanalyseerd in een enkele QFA experiment wordt alleen beperkt door de beschikbare ruimte in een broedstoof of warme kamer, de minimum toegestane beeldregistratie frequentie en de maximaal haalbare vangen frequentie van het aantal platen in een vloeistof groei experiment sterk beperkt de capaciteit de plaatlezer (gewoonlijk een of twee platen) of van de stapelaar aan de plaatlezer (gewoonlijk 25 tot 50 platen). We hebben onlangs een volledig geautomatiseerde QFA experiment op 123 platen, elk met 308 experimentele culturen, het geven van 37.884 gelijktijdige culturen. We schatten dat het maximaal haalbare aantal onafhankelijke culturen groeien in vloeistof is 96 (culturen / plaat) x 50 (platen / stapelaar) = 4800, dat is ongeveer tien keer minder dan onze QFA doorvoer. Een alternatief voor vloeibare cultuur schermen is het gebruik van vele geautomatiseerde growth apparaten parallel (tabel 1 van het onderzoek van Blomberg 8), elk met een capaciteit van een of twee platen. Temperatuurregeling in elk apparaat onafhankelijk is, en dus voorwaarden zijn niet identiek, maar in de veronderstelling dat ze zijn, zouden deze workflow moet ten minste 190 dergelijke apparaten QFA doorvoer (ervan uitgaande dat 200 vloeibare culturen per apparaat) te passen.
Samengevat QFA een hoogwaardige workflow, die kunnen worden toegepast kwantitatieve groei fenotypen verzamelen zowel kleinschalige gericht experimenten en hoog-schermen. Het is flexibel genoeg om effectief te worden toegepast met verschillende eisen voor de robot apparatuur. De computationele component van de QFA workflow is gebaseerd op de vrij beschikbare, open source code.
The authors have nothing to disclose.
We dankbaar erkennen alle leden van ons laboratorium en het Centrum voor Integrated System Biologie van Ageing and Nutrition (CISBAN) voor de ondersteuning en behulpzaam discussies. Deze studie werd ondersteund door biotechnologie en biologische wetenschappen Research Council (BBSRC) (BB/C008200/1) en de Wellcome Trust (075.294, 093.088).
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
Replica Plater | Sigma | R-2508 | 96 pin manual pintool with 1/8 ” diameter pins |
Mix Mate | Eppendorf | 5353 000.014 | |
Biomek FX | Beckman | A31842 | |
Teleshake | Thermo Scientific | 50095890 | Installed on Biomek FX |
BM3-SC | S&P Robotics Inc | BM3-SC | 192 shelf rotating carousel |
spImager | S&P Robotics Inc | spImager | High resolution manual imaging |
spImager with Cytomat | S&P Robotics Inc | Custom | Temperature controlled automated high resolution imaging |
Cytomat 6001 with heat exchanger | Thermo Scientific | 51022222 | Attached to spImager |
Ecoline RE207 | Lauda | RE207 | Attached to Cytomat |
spImager with carousel | S&P Robotics Inc | Custom | Automated high resolution imaging |
Robot pin tool fixture for FP12pins | V&P Scientific | AFIX96FP12 | N/A |
96 x FP12 pins | V&P Scientific | FP12 | 50.4 mm long, 17 mm exposed pin length |
Docking Station for Pin Tool | V&P Scientific | VP425 | Docking station base removed to allow fan drying of pins |
Pin Cleaning Brush | V&P Scientific | VP425 | N/A |
Replica Plater | Sigma | R-2508 | Manual pin tool |
Nunc OmniTray with Lid | Nunc | 734-0490 | N/A |
96 well sterile polystyrene plates | Greiner BioOne | 655161 | N/A |
96 well sterile polystyrene lids | Greiner BioOne | 656171 | N/A |
Table 3. Specific reagents and equipment.