Isolamento di cellule immunitarie di tumori primari

1. Isolamento di cellule mieloidi da tumori della prostata TRAMP Tutte le procedure sono state eseguite sotto la guida di un comitato di revisione animale. Topi TRAMP sviluppano spontaneamente tumori prostatici autoctoni come risultato di un transgene (SV40) controllata dal promotore probasin 10. Qualsiasi topo maschio può essere utilizzato per questa procedura. Mentre tumori TRAMP può essere raccolto a qualsiasi età, va notato che TRAMP tumori prostatici rimangono generalmente piccolo fino raggiungere i topi età superiore a 20 settimane. Euthanize topi CO 2 asfissia. Rimuovere il tratto urogenitale (UGT), tagliando aperta la cavità peritoneale e tirando indietro il tessuto adiposo. Il tessuto adiposo è spumeggiante, tessuto scintillante cercando. Individuare la vescica, si trova direttamente tra le due grandi bianchi, vescicole seminali. Trattenere la vescica con una pinza. Mantenere chiuse le forbici, appianare tessuto adiposo e individuare l'uretra. Ridurre il urethra più vicino possibile al cingolo pelvico possibile e recidere i vasi deferenti. Mentre il taglio verso il basso, contemporaneamente tirare verso l'alto la vescica. Questo rilascerà il UGT intero che può ora essere micro-dissezione per ottenere ciascuno dei lobi della prostata. Posizionare la UGT in PBS temperatura ambiente. Utilizzare un microscopio da dissezione per visualizzare la UGT e sgombrare il campo da ogni eccesso di tessuto adiposo. Utilizzando pinze, tenere su l'uretra e raccogliere i lobi ventrali, laterale e anteriore della prostata. Posizionare il tessuto in PBS mentre si raccolgono il resto dei lobi. Rimuovere le vescicole seminali e scartare. Girare il restante tessuto 180 °. Raccogliere la ghiandola della prostata ampollare e lobi dorsali. Utilizzando pinze, prendere in giro a parte il tessuto prostatico e posizionarlo nella digestione (dissociazione) buffer. Posto tessuto tumorale in 1 ml di tampone di dissociazione (100 U / ml Collagenasi tipo IV e 100 pg / ml DNasi in RPMI + 10% FBS). Ogni tumore può requira uniche condizioni di dissociazione, per TRAMP tumori prostatici, usare 1 ml e per B16 tumori, utilizzare 5 ml (vedi sotto). Nota: il grado di collagenasi (I-IV) dipenderà dalla popolazione di cellule ad essere isolata; isolamento cellulare mieloide è migliore con tipo IV, mentre la resa è superiore utilizzando linfociti di tipo I. Tubo posto in incubatore a 37 ° C per 30 min. Pipettare su e giù con una pipetta da 1 ml per ottenere una sospensione che scorre facilmente singola cella. Filtrare sospensione filtro 70 micron e lavare 3x con separazione tampone MAC supplementato con 10% FBS per isolamento delle cellule mieloidi. Centrifugare sospensione cellulare a 400 xg per 10 min. Risciacquare il pellet con 10 ml di tampone MAC e centrifugare di nuovo con le stesse impostazioni. Risospendere il pellet di cellule in 100 microlitri di buffer MAC. Successivamente, aggiungere 1 pg anti-CD16/32 anticorpo (Ab) per 10 8 celle (200 pl 2.4.G2 ibridoma supernatante di coltura) e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Nota: tegli quantità di γ-FcR blocco anticorpo (Ab) da aggiungere può variare a seconda della frequenza / numero di FcR-y + cellule del tessuto e il volume della sospensione cellulare, pertanto, questo passo può richiedere di ottimizzazione. Aggiungere 100 ml di "Pan-DC" o 10 microlitri di anti-CD11b, anti-CD11c o anti-PDCA-1 microsfere per 10 8 cellule totali, a seconda della popolazione cellulare desiderato. Nota: la quantità di microsfere richieste può variare a seconda della frequenza / numero di cellule della popolazione desiderata nel tessuto, pertanto, questo passo può richiedere di ottimizzazione. Mescolare bene con delicatezza sfogliando tubo (Do Not Vortex) e incubare per 15 min a 4-8 ° C, al riparo dalla luce. Non incubare in ghiaccio. Lavare le cellule aggiungendo 10 ml di tampone MAC. Centrifugare a 400 xg per 10 min. Eliminare completamente il surnatante e risospendere le cellule in 500 microlitri di buffer di MAC. Sospensioni di cellule tumorali fluire meglio attraverso le colonne LC. (Altroscelte: MS, LS, LD). Applicare una colonna fresco al separatore magnete. Prime la colonna risciacquando con una quantità appropriata di buffer di MAC per la colonna selezionato: per LC e colonne MS usare 500 microlitri. Per LS o LD colonne utilizzare 1 ml. Dopo innesco della colonna, applicare sospensione cellulare sulla sommità della colonna. Utilizzare una colonna per ogni x 1 10 8 celle. Raccogliere cellule non marcate (pass-through) e lavare la colonna di un minimo di tre (fino a cinque) volte con 500 pl di volume per un totale di 1,5-2,5 ml di fluido per il lavaggio. Eseguire la fase di lavaggio 1 con l'aggiunta di tampone MAC alla colonna, è importante mantenere il flusso colonna. Non appena la colonna gocciola l'ultima goccia, aggiungere più tampone. Non lasciate colonna senza flusso o farlo girare a secco (questo non può essere sottovalutata, l'essiccazione della colonna può rovinare la purezza e portare a una significativa perdita di vitalità cellulare.). Per la fase di lavaggio 2, lavare la colonna con mix dissociazione buffer (contenente Collagenasi + DNase come dedescritto al punto 1.7), questo serve come un passo "più dura" wash per scovare i residui appiccicosi dalle cellule tumorali morte o morenti. Eseguire la fase di lavaggio 3 con buffer di MAC, se il flusso attraverso non sembra del tutto chiaro dopo la fase di lavaggio, 3, continuano a lavare per 2 operazioni di lavaggio supplementari con MAC buffer (per un totale di 5 lavaggi). Per grandi tumori sottocutanei (ad esempio, melanoma B16), durante l'ultimo lavaggio, applicare una leggera pressione con un dito guantato alla sommità della colonna, questo rilascia detriti extra per un detergente, purificato popolazione di cellule. Questa fase non è richiesta per tumori dei tessuti solidi come prostata, invece, utilizza operazioni di lavaggio supplementari, lavando un totale di almeno 5-6 volte. Rimuovere colonna dal separatore magnetico e posizionarlo su un tubo di raccolta adeguato. Pipettare 2 ml di tampone sulla colonna. Raccogliere le cellule marcate magneticamente saldamente applicando lo stantuffo fornito con la colonna. Contare numero di cellulare e confermare la purezza per la popolazione cella selezionatacitometria a flusso. Per l'identificazione delle popolazioni DC, marcatori suggeriti includono CD45, CD11c, PDCA-1, B220 e CD11b. Marcatori macrofagi suggerite includono CD45, CD11b, F4-80, e Ly6C. 2. Isolamento di Adoptively trasferiti da cellule T sottocutaneo B16 melanoma Questo protocollo funziona meglio con i tumori che sono di 250 mm 2 o inferiore (stimata misurando diametri bisettrici del tumore). B16 cellule tumorali sono state iniettate per via sottocutanea in topi C57BL / 6 e misurazioni del tumore sono stati registrati ogni 2 giorni 8. I topi con tumori di circa 250 mm 2 eutanasia sono da CO 2 asfissia. Uso autoclave strumenti chirurgici sciacquati con 70% EtOH, tagliato in piccoli tumori (<3 mm) e incubare pezzi in 5 ml di soluzione di dissociazione (terreno RPMI supplementato con 5% FBS, collagenasi tipo I (200 U / ml) e DNasi I (100 pg / ml)) per 30 min a 37 ° C, Pipettaggio (usando un 1.000 μl punta della pipetta) e vortex ogni 10 minuti durante l'incubazione. Se le cellule mieloidi verrà successivamente isolato, sostituire il 5% FBS e collagenasi di tipo I con 10% FBS e collagenasi di tipo IV (200 U / ml), rispettivamente. Dopo l'incubazione, sospensione di cellule passano attraverso un filtro 70 micron delle cellule e lavare due volte con 10 ml MAC buffer (preparata secondo le istruzioni del fabbricante, Miltenyi Biotech). Opzionale – per tumori molto grandi (> 300 mm 2), cellule infiammatorie possono essere pre-arricchito con centrifugazione in gradiente di densità (Percoll o Ficoll). Aspirare il surnatante lavaggio e aggiungere 1 mg anti-CD16/32 antibody/10 8 celle (200 microlitri di supernatante clone cultura 2.4.G2) e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Senza lavare, aggiungere 1 mg Thy1.1 anticorpo anti-PE per 10 a 8 celle, mescolare bene con delicatezza sfogliando il tubo ed incubare per 30 minuti in ghiaccio, al riparo dalla luce. Lavare le cellule per rimuovere legato prianticorpo mary aggiungendo 10 ml tampone MAC e centrifugare a 400 xg per 5 minuti. Aspirare il surnatante e aggiungere 20 microlitri anti-PE microsfere (Miltenyi Biotech) per 10 7 cellule totali, secondo le istruzioni del produttore. Mescolare bene con delicatezza sfogliando tubo (non vortex) e incubare a 4 ° C (non usare il ghiaccio) per 15 minuti, al riparo dalla luce. Attenzione: vortex può diminuire l'integrità delle perline. Lavare le cellule aggiungendo 10 ml di tampone MAC e centrifugare a 400 xg per 5 minuti. Aspirare cellule surnatante, e risospendere in 500 microlitri di buffer MAC. Per i tumori di maggiori dimensioni (> 300 mm 2), utilizzare 1 ml di tampone. Mettere una LC (a grandi cellule) della colonna nel separatore di campo magnetico. Sospensioni di cellule tumorali fluire meglio attraverso queste colonne. Lavare la colonna con 500 microlitri di buffer MAC per innescare la colonna. La maggior parte dei tumori vengono trasmessi attraverso la LS e colonne LD, ma richiedono un ulteriore digestione e meccanica disruption per raggiungere il livello adeguato di sospensione di singola cellula. Lavare la colonna con 1 ml di tampone MAC per innescare la colonna. Applicare sospensione cellulare sulla colonna e permettono di scorrere completamente attraverso (senza lasciare la corsa colonna a secco). Successivamente, lavare con 500 microlitri di buffer MAC, e ripetere il lavaggio 3x. Solo aggiungere nuovo buffer quando il serbatoio colonna è vuota, ma non lasciare che la colonna di stare in piedi senza flusso. Questo farà sì che l'intasamento e la purezza diminuita. Questo è un passo fondamentale per i grandi tumori sottocutanei: Dopo l'ultimo lavaggio, con una punta di dito guantato, applicare una leggera pressione nella parte superiore della colonna, mentre ancora il separatore magnetico. Questo rilascia detriti in più per una popolazione più puramente arricchito. Successivamente, lavare la colonna 1 volta di più con 500 microlitri di buffer MAC. Rimuovere colonna dal separatore e collocarlo in una provetta pulita da 15 ml, aggiungere 2 ml di buffer di MAC sulla colonna. Lavare il magneticamente marcato cells di spingendo lo stantuffo nella colonna. Centrifugare la frazione eluita a 400 xg per 5 min. Purezza in questa fase è in genere tra 75-80%. Per ottenere la purezza> 90%, ripetere la procedura di separazione magnetica come descritto nel passaggio 1,10-1,12 con una nuova colonna MS. La colonna MS è più piccolo e più compatto, la sospensione verrà eseguito più lentamente attraverso la colonna, ma darà i numeri più alti e la purezza della cellula di interesse. Contare il numero di cellule per ulteriori esperimenti e verificare la purezza attraverso l'analisi di citometria di flusso. Per l'isolamento di cellule T adoptively trasferiti come quelli descritti in questo protocollo, i marcatori alleliche per l'identificazione sono CD45 e Thy1.1 (cellule trasferiti) e Thy1.2 (host cellule T). 3. Risultati rappresentativi La resa di una particolare popolazione di cellule (cioè, macrofagi, cellule T DC, ecc) varia a seconda delle dimensioni del tumore e trattamenti che erano amministratoremente registrato durante la crescita del tumore. Una prostata da un trattato del mouse 14-16 settimane di età TRAMP dovrebbe produrre tra i 5 8×10-1×10 6 CD11c + / PDCA-1 + (DC), le cellule al 90-95% di purezza o 1×10 6-1.5×10 6 F4/80 + / CD11b + (macrofagi) a 80-90% di purezza da 300 mg di tessuto seguendo il protocollo di isolamento sopra, come mostrato nella Figura 1. Il numero di ciascuna di queste cellule aumenta leggermente al momento del trasferimento adottivo di antigene tumore-cellule T specifiche. Scarsa purezza è solitamente un risultato di lavaggio insufficiente, consentendo la colonna asciugare (che può provocare la ritenzione detriti tumore nella colonna), o insufficiente recettore Fc blocco. Analogamente, le cellule totali isolate da B16 tumori anche variare a seconda delle dimensioni del tumore al momento della raccolta del tessuto e trasferimento adottivo di cellule T (trasferimento di 5×10 6) con o senza vaccino DC (trasferimento di 1×10 5). Pochissimi antigene-spespecifici cellule T infiltrarsi meno un antigene tumore-pulsato vaccino DC è dato un giorno dopo il trasferimento delle cellule T. Se un vaccino DC viene somministrato a un topo recante un piccolo, palpabile (<50 mm 2) tumorale, una resa di circa 3×10 5 Thy1.1 + cellule T, con una purezza del 80-85%, sarebbe considerato un "buon "raccolto, come mostrato in Figura 2A. Tuttavia, se i tumori più grandi sono raccolte, resa totale e la purezza sarà ridotto. I macrofagi (F4/80 + / CD11b +) sono di solito una piccola percentuale delle cellule totali in B16 tumori. Figura 2B mostra che utilizzando CD11b, da un tumore che è di 250 mm 2, rese circa 1×10 6 macrofagi a 90-95% di purezza . Ulteriormente, figura 2B mostra che la popolazione DC in B16 tumori sono eterogenei. A differenza dei tumori della prostata, due sottopopolazioni: CD11c + / PDCA-1 + (plasmacitoidi DC) e CD11c+ / PDCA-1 – (convenzionale DC) può essere ottenuto da B16 melanoma. Si stima che circa 6 pDC 2×10 e 4×10 6 CDC sono attesi da 250 mm 2 B16 tumori a 80-90% di purezza. Purezza Ridotto è di solito un risultato di non cancellare le cellule tumorali dalla colonna. Fase 2,12 è un punto critico per rimuovere il piccolo ciuffo di cellule di melanoma che persiste alla base della colonna. Dopo questo passaggio migliora l'efficacia delle fasi di lavaggio e si traduce in una migliore purezza. Figura 1. DC (CD11c + / PDCA-1 +) e macrofagi (F4/80 + / CD11b +) sono stati isolati da un tumore alla prostata TRAMP. Valori di dot plot rappresentano la percentuale di cellule di interesse pre-o post-purificazione. Figura 2. (A) Adoptively trasferito Thy1.1 + / CD8 + e cellule T (B) tra le cellule mieloidi CD11c + / PDCA-1 + plasmacitoidi DC, CD11c + / PDCA-1 – DC convenzionali e F4/80 + CD11b + / macrofagi sono stati isolati da via sottocutanea B16 del tumore da melanoma Thy1.2 topi +. Valori di dot plot rappresentano la percentuale di cellule di interesse pre-o post-purificazione.