Использование незаписанные, замороженные ткани для изучения природных распространения Муцин
Summary
Незаписанные замороженных образцов тканей, встроенные в оптимальной температуры среды резки (ОКТ) могут быть использованы для изучения распределения природного и гликозилирования выделяется слизь. В этой обработке тканей подход является минимальным и природных презентация гликолипиды, муцина и гликана-эпитопы сохраняется. Срезы тканей могут быть проанализированы с помощью иммуногистохимии с помощью флуоресцентной или хромогенных обнаружения.
Abstract
Mucins are complex and heavily glycosylated O-linked glycoproteins, which contain more than 70% carbohydrate by weight1-3. Secreted mucins, produced by goblet cells and the gastric mucosa, provide the scaffold for a micrometers-thick mucus layer that lines the epithelia of the gut and respiratory tract3,4. In addition to mucins, mucus layers also contain antimicrobial peptides, cytokines, and immunoglobulins5-9. The mucus layer is an important part of host innate immunity, and forms the first line of defense against invading microorganisms8,10-12. As such, the mucus is subject to numerous interactions with microbes, both pathogens and symbionts, and secreted mucins form an important interface for these interactions. The study of such biological interactions usually involves histological methods for tissue collection and staining. The two most commonly used histological methods for tissue collection and preservation in the clinic and in research laboratories are: formalin fixation followed by paraffin embedding, and tissue freezing, followed by embedding in cryo-protectant media.
Paraffin-embedded tissue samples produce sections with optimal qualities for histological visualization including clarity and well-defined morphology. However, during the paraffin embedding process a number of epitopes become altered and in order to study these epitopes, tissue sections have to be further processed with one of many epitope retrieval methods13. Secreted mucins and lipids are extracted from the tissue during the paraffin-embedding clearing step, which requires prolong incubation with organic solvents (xylene or Citrisolv). Therefore this approach is sub-optimal for studies focusing on the nature and distribution of mucins and mucus in vivo.
In contrast, freezing tissues in Optimal Cutting Temperature (OCT) embedding medium avoids dehydration and clearing of the sample, and maintains the sample hydration. This allows for better preservation of the hydrated mucus layer, and thus permits the study of the numerous roles of mucins in epithelial biology. As this method requires minimal processing of the tissue, the tissue is preserved in a more natural state. Therefore frozen tissues sections do not require any additional processing prior to staining and can be readily analyzed using immunohistochemistry methods.
We demonstrate the preservation of micrometers-thick secreted mucus layer in frozen colon samples. This layer is drastically reduced when the same tissues are embedded in paraffin. We also demonstrate immunofluorescence staining of glycan epitopes presented on mucins using plant lectins. The advantage of this approach is that it does not require the use of special fixatives and allows utilizing frozen tissues that may already be preserved in the laboratory.
Protocol
Discussion
Сохранение слизи и гликана эпитопов в замороженных тканях выше, чем в тканях, которые были внедрены в парафин. Мы продемонстрировали сохранение секретируемых слой слизи (рис. 1 и 3) и распределения из трех гликанов структуры (рис. 3) в замороженных тканях по сравнению с парафином тканях. Специализированная фиксаторы, такие, как решение Карнуа (60% этанола, 30% хлороформа, 10% уксусной кислоты) 17 были разработаны для оптимального сохранения слизистого слоя в образцах тканей. Оптимально, это решение должно быть использован для сбора образцов ткани, которые предназначены для исследования слизи и был показан сохранить гладкую появление слизи слоем 16-17. Слой слизи в незаписанных замороженные образцы встроенные в октябре появляется прочная и в некоторых районах может отделяться от тканей, однако общая толщина слоя находится в согласии с этим наблюдается в тканях, которые были зафиксированы с решением Карнуа и embeddред в парафин 16-17. Например, слой слизи в замороженных тканях человека разделе толстой кишки составляет ~ 100 мкм (рис. 1), которая находится в пределах сообщалось Carnoy's фиксированной человека образца толстой кишки 55,4 ± 2,5 мкм (в диапазоне 7,7 – 204,8 мкм) 16.
Она была известна на протяжении десятилетий, что этанол приводит к обезвоживанию ~ 30% сокращение биологических образцов 18, и что органические растворители, такие как ксилол, хлороформ и Citrisolv экстракт липидов, гликолипидов и, в некоторой степени, белков из тканей 13. Ткань для обработки парафин вложения включает в себя следующие действия: фиксация (10% буферном растворе формалина), обезвоживание (увеличение концентрации этанола) и очистки (Citrisolv или ксилол). По имитируя эти действия на нефиксированные замороженных срезов ткани, мы показали, что Citrisolv извлекает слизи из замороженных срезов ткани в результате чего ткани морфологии, который похож на парафин тканей (FigurE 2, справа). В отличие от слизистого слоя не была изменена путем инкубации с формалином или этанола (рис. 2, слева и в центре панели). Это говорит о том, что на поляне шаг стандартная процедура вложения парафин, который требует длительной инкубации в Citrisolv / ксилол, приводит к краху слой слизи. Формалин фиксации не повредить слой слизи и замороженных срезов тканей, которые были зафиксированы с формалином может быть легко окрашивается с лектинов и антител против гликанов, гликолипиды и белки (рис. 2, 3 и 6). Эти эффекты могут быть незначительными для изучения мембран-связанных белков и тканей патологии, но они являются разрушительными для высоко гидратированных структур, таких как выделяемый слой слизи. Однако гистологические исследования муцина по-прежнему осуществляются преимущественно с парафином образцов, в которых сохранение слой слизи является оптимальным решением. В углубленный анализ слой слизи композиции, такие как точная идентичность себеcreted или мембраносвязанных MUC комбинации гликопротеин требуют специфических антител и масс-спектрометрии для идентификации белков магистралей. Сохранение слой слизи является лишь начальным требованиям для таких исследований.
Многие лаборатории образцы тканей замораживали в октябре, что было собрано в прошлом для различных проектов, эти ткани могут быть легко использованы для изучения муцин, гликолипиды и гликана распределения избавляя пользователя от необходимости собирать тканей в специальных фиксаторов, которые предназначены исключительно для сохранения слизи. Замороженные ткани подвергаются минимальной обработке, и поэтому естественное распределение гликанов, которые являются гидратированные в природе, сохраняется. Это особенно важно в области микробных-хозяин взаимодействий. Знание натуралистического распределение и численность муцинов секретируемых и многие структуры гликанов украшении этих "барьеров" молекул будет ключевым в понимании иммунной защиты, микробные эксплуатации и возбудителиесть.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Николь М. Немет (Университет штата Джорджия) и Жанна М. Fair (LANL) за помощь в уборке куриные тканей, и Steven A. Springer за его помощь во время съемок. Обо всех птиц в этом исследовании был в соответствии с Национальными Институтами Здоровья руководящие принципы для гуманного использования лабораторных животных, а все протоколы были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета в Лос-Аламосской национальной безопасности, LLC, оператор в Лос-Аламосе Национальная лаборатория по контракту № DE-AC52-06NA25396 с министерством энергетики США. Уход за мышами в данном исследовании, в соответствии с UCSD животных утвержденным протоколом. Ткани человека были получены в рамках UCSD протокол IRB утвержден. Эта работа была поддержана грантом 118645 из Университета Калифорнии Лаборатории стоимость программы Президента (PG) и гранта NS047101 из Национального института неврологических расстройств и инсульта (Neuroscience микроскопии общего фонда, UC San Diego).
Materials
| Name of reagent and equipment | Company | Catalogue number |
| 2-methyl butane | Fisher Scientific | 03551-4 |
| AEC peroxidase substrate kit | Vector Labs | SK-4200 |
| Alcian Blue | Sigma-Aldrich | A3157 |
| Anti-CA 19-9 monoclonal antibody | Calbiochem | CA1003 |
| Anti-MUC5AC monoclonal antibody | Millipore | MAB2011 |
| Avidin-Biotin blocking kit | Vector Labs | SP-2001 |
| Biotinylated donkey anti-mouse antibody | Jackson Immunoresearch | 90863 |
| Biotinylated SNA | Vector Labs | B-1305 |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 |
| Chitin-hydrolysate | Vector Labs | SP-0090 |
| Cryostat microtome | Leica Microsystems | Leica CM 1800 |
| Hematoxylin | Surgipath Medical Ind. | 3801570 |
| Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | H325-100 |
| Jacalin-FITC | Vector Labs | FL-1151 |
| Mayer’s Hematoxylin | Sigma-Aldrich | MHS32 |
| Melibiose | Sigma-Aldrich | M5500 |
| Nuclear Fast Red | Vector Labs | H-3403 |
| OCT compound | VWR International | 25608-930 |
| Peroxidase conjugated streptavidin | Jackson Immunoresearch | 94638 |
| Schiff reagent | Electron microscopy sciences | 26052 |
| sWGA-Rhodamine | Vector Labs | RL1022S |
| TKH2 monoclonal antibody | ATCC | HB-9654 |
| VectaMount aqueous mounting media | Vector Labs | H-5501 |
| Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-4 |
| Peel-A Way molds | Polysciences Inc. | 18646A-1 |
References
- Slayter, H. S., Wold, J. K., Midtvedt, T. Intestinal mucin of germ-free rats. Biochemical and electron-microscopic characterization. Carbohydr. Res. 222, 1-9 (1991).
- Lamblin, G. The carbohydrate diversity of human respiratory mucins: a protection of the underlying mucosa. Am. Rev. Respir. Dis. 144, S19-S24 (1991).
- Corfield, A. P., Carroll, D., Myerscough, N., Probert, C. S. Mucins in the gastrointestinal tract in health and disease. Front. Biosci. 6, D1321-D1357 (2001).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat. Rev. Immunol. 9, 799-809 (2009).
- Lievin-Le Moal, V., Servin, A. L. The front line of enteric host defense against unwelcome intrusion of harmful microorganisms: mucins, antimicrobial peptides, and microbiota. Clin. Microbiol. Rev. 19, 315-337 (2006).
- Kim, Y. S., Ho, S. B. Intestinal goblet cells and mucins in health and disease: recent insights and progress. Curr. Gastroenterol. Rep. 12, 319-330 (2010).
- Nochi, T., Kiyono, H. Innate immunity in the mucosal immune system. Curr. Pharm. Des. 12, 4203-4213 (2006).
- Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: soldier in the fight against respiratory viruses. Clin. Microbiol. Rev. 24, 210-229 (2011).
- McGuckin, M. A., Linden, S. K., Sutton, P., Florin, T. H. Mucin dynamics and enteric pathogens. Nat. Rev. Microbiol. 9, 265-278 (2011).
- Knowles, M. R., Boucher, R. C. Mucus clearance as a primary innate defense mechanism for mammalian airways. J. Clin. Invest. 109, 571-577 (2002).
- Johansson, M. E. The inner of the two Muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 15064-15069 (2008).
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat. Rev. Immunol. 10, 159-169 (2010).
- Hayat, M. A., Hayat, M. A. . Microscopy, Immunohistochemistry, and Antigen Retrieval Methods: For Light and Electron Microscopy. , 53-70 (2002).
- Cohen, M., Hurtado-Ziola, N., Varki, A. ABO blood group glycans modulate sialic acid recognition on erythrocytes. Blood. 114, 3668-3676 (2009).
- Cohen, M., Varki, A. The sialome–far more than the sum of its parts. OMICS. 14, 455-464 (2010).
- Ota, H., Katsuyama, T. Alternating laminated array of two types of mucin in the human gastric surface mucous later. Histochemical J. 24, 86-92 (1992).
- Matsuo, K., Ota, H., Akamatsu, T., Sugiyama, A., Katsuyama, T. Histochemistry of the surface mucous gel layer of the human colon. Gut. 40, 782-789 (1997).
- Boyde, A., Maconnachie, E. Treatment with lithium salts reduces ethanol dehydration shrinkage of glutaraldehyde fixed tissue. Histochemistry. 66, 181-187 (1980).
