Utilisation non fixés, des tissus congelés pour étudier la distribution mucine naturel

1. Enrobage des tissus dans de l'OCT Préparer un bain de gel en ajoutant de la neige carbonique en 2-méthyl butane dans une zone peu profonde en polystyrène. Récolter le tissu, et lentement humide sur un papier tissu à sécher le liquide en excès. Si vous utilisez composant logiciel enfichable congelés tissu (tissu qui a été congelé dans l'azote liquide), laisser le tissu se réchauffer à -20 ° C en le plaçant dans une chambre cryo-microtome. Ajouter une petite quantité de l'OCT dans le moule Peel-A-Way congélation, juste assez pour couvrir le fond du moule. Placer le tissu dans le moule, s'assurer que le tissu est posé sur le fond du moule à l'orientation souhaitée. Une fois congelé, le bloc de coupe de tissu est supporte par le dessous ou par les côtés. Couvrir le tissu avec octobre, et placer le moule dans le bain de congélation. Le composé OCT devient blanc que le tissu se fige. Une fois congelés, peler le moule hors du bloc congelé et placer dans un sac de congélation marquée. Les blocs congelés peuvent être conservésà -80 ° C jusqu'à utilisation. 2. Sectionnement des tissus Placez les blocs de tissus dans la chambre cryo-microtome, et leur permettent d'atteindre -20 ° C (30 min environ). Coupez une section de 5.3 microns d'épaisseur, et placez une lame de verre chargée positivement au-dessus de la section. Le tissu adhère à la lame. Air sécher les tissus pendant 30-60 min. Les diapositives peuvent être utilisées à ce stade, ou ils peuvent être conservés à -80 ° C pour une utilisation ultérieure. 3. Coupes Les diapositives qui ont été stockés à -80 ° C: laisser les lames de dégeler et de l'air sec à température ambiante pendant 30 min. Fixer les lames avec 10% du formol tamponné pendant 30 min à température ambiante. Laver trois fois dans du PBS ou tampon TBST, pour chaque lavage tremper les lames 10 fois dans 250 ml de tampon. Tampon PBS peut être utilisé pour le marquage en immunofluorescence, cependant, pour la détection chromogénique avec la phosphatase alcaline ConjugATED anticorps, TBST doit être utilisé depuis le phosphate dans du PBS inhibe l'activité de la phosphatase alcaline. Coupes de tissus transparents sont maintenant prêts à être colorés. 4. Utilisation colorations histochimiques comme le Bleu Alcian et Schiff acide périodique pour détecter mucus Bleu Alcian tache: Rincer les lames dans de l'eau, incuber dans de l'acide acétique à 3% pendant 3 min à température ambiante. Colorer avec Alcian Blue 2.5 pH solution pendant 30 min à température ambiante. Laver les lames à l'eau courante pendant 10 minutes, rincer à l'eau déminéralisée. Contre-colorer en rouge rapide nucléaire pendant 5 min à température ambiante. Laver les lames trois fois dans de l'eau déminéralisée. Periodic Acid Schiff tache: Rincer les lames dans de l'eau, incuber dans fraîchement préparée d'acide périodique 1% pendant 5 min. Laver trois fois dans de l'eau DI, tremper dans l'eau une fois miliQ. Colorer avec le réactif de Schiff pendant 15 min à températur ambiantee. Laver les lames à l'eau courante pendant 10 minutes, rincer à l'eau déminéralisée. Contre-colorer en Surgipath hématoxyline pendant 30 sec à température ambiante. Laver les lames trois fois dans de l'eau déminéralisée. Incuber les lames 30 secondes dans de l'eau du robinet de Scott à la température ambiante. Laver trois fois dans de l'eau déminéralisée. Déshydrater et nettoyer les lames en les incubant 1 min dans de l'éthanol à 95%, suivie de trois changements rapides dans l'éthanol à 100%, et trois changements de Citrisolv, 2 min chacun. Le tout à température ambiante. Montez diapositives sur des lamelles avec le milieu résineux (Cytoseal 60). 5. Utilisation lectines et anticorps (Tableau 1) pour détecter des épitopes Glycan par des méthodes histochimiques Pour la détection par fluorescence d'épitopes glycanes trois en utilisant des lectines, bloquer les lames avec 1% de BSA dans du PBS pendant 10-30 min à température ambiante. Depuis une lectine biotinylée est utilisée, empêcher la biotine endogène par incubation de 15 min avec 0,1%L'avidine, suivi par 15 minutes d'incubation avec de la biotine 0,01% à température ambiante. Laver les lames dans du PBS après chaque étape de blocage. Fraîchement préparer un mélange de 1 ug / ml de rhodamine conjuguée succinylée agglutinine de germe de blé (sWGA), 1,3 ug / ml biotinylé Sambucus nigra agglutinine (SNA) et 5 ug / ml conjuguée à la fluorescéine jacaline dans HEPES / NaCl (10 mM HEPES, NaCl 150 mM pH 7,5). Placer les lames sur une surface plane ou dans une boîte de coloration, et la couche du mélange sur le dessus lectine. Le volume de mélange peut être réduite en plaçant doucement parafilm sur le liquide, le parafilm aplatit le liquide et empêche l'évaporation. Incuber 1 heure à température ambiante dans l'obscurité. Laver les lames trois fois avec du PBS. Glissements de couches avec 0,7 pg / ml de streptavidine conjuguée CY5 (pour détecter la biotinylé-SNA), et incuber pendant 30 min à température ambiante dans l'obscurité. Laver les lames trois fois avec du PBS. Contre-noyaux avec 0,1 m &u, g / ml DAPI. Montez diapositives sur des lamelles avec un milieu aqueux comme milieu de montage VectaMount (ou tout autre support aqueux). 6. Contrôle de la spécificité de coloration Lectine Spécificité de coloration lectine est commandé soit par un clivage enzymatique spécifique d'épitope cible glycane avant la coloration ou par compétition avec des molécules de petite taille. Le clivage enzymatique de Sambucus nigra agglutinine (SCN) une spécificité de liaison Diluer Arthrobacter ureafaciens sialidase (AUS) à 250 mU / ml dans 50 mM d'acétate de sodium pH 5,5. Ajouter de l'eau au fond d'un vide Tip-Box, cela formera une chambre humide pendant l'incubation. Placer les lames face visible sur le plateau supérieur de la pointe-boîte, couche 150-200 AUS ul de solution sur la lame et recouvrir d'une lamelle. Eviter la formation de bulles d'air. Fermez le couvercle de la boîte et incuber à 37 ° C pendant 2,5 heures. Laver les lames trois fois dans du PBS à tempérament chambrerature pour enlever tous les acides sialiques libres. Ces lames doivent être négatifs pour la coloration du SCN. Inhibiteurs compétitifs pour jacaline et succinylée germe de blé agglutinine (sWGA) spécificité Aliquote de 200 ul du mélange de lectine préparée à l'étape 5.4 à deux flacons Eppendorf. Ajouter 200 mM (inhibiteur de jacaline) Melibiose l'une quelconque des flacons et l'hydrolysat de chitine-dilution 1:10 (sWGA inhibiteur) à l'autre flacon. Diapositives de superposition de contrôle négatif avec les inhibiteurs contenant du mélange et incuber 1 h à température ambiante, en même temps que le reste des diapositives. Ces lames doivent être négatif pour jacaline ou coloration sWGA, respectivement. 7. Les résultats représentatifs Une comparaison entre des échantillons de tissus inclus dans la paraffine pour les tissus congelés embarqués en cryo-protecteurs médias (OCT) a révélé différence frappante dans la préservation et la qualité de la coloration pour muciglycoprotéines n. La coloration des tissus avec des colorants histochimiques, tels que le Bleu Alcian et acide périodique Schiff, produire des résultats très différents dans des coupes de tissus congelés ou comparables de paraffine échantillons embarqués (Figure 1). Il semble que le solvant organique (xylène ou Citrisolv) qui est utilisé pendant le processus de l'inclusion en paraffine affecte la distribution des mucines sécrétées sur l'épithélium ainsi que la suppression de beaucoup les glycolipides à partir des échantillons (figure 2). En conséquence, la couche de mucus semble effondré sur les cellules de la muqueuse et se trouve surtout dans les cellules caliciformes. Congélation instantanée des tissus en cryo-protecteurs des médias (OCT) a maintenu l'hydratation de l'échantillon et conservé les dimensions sécrétées couche mucines. Le procédé d'enrobage de paraffine affectée autres mucus-glycanes et des glycolipides associés d'une manière similaire. La distribution Glycan été examinée en utilisant des lectines, qui sont couramment utilisés pour la détection de glycane (figure 3) et des anticorps contre des épitopes présents surmucines et des glycolipides (figure 6). Parce lectine n'est pas bien définie et est affectée par la répartition spatiale des glycanes ainsi que la structure glycane 14,15, il est important d'appliquer les contrôles appropriés pour la coloration de lectine. Ici, nous démontrons deux méthodes pour contrôler coloration lectine sur les tissus testés: clivage enzymatique et inhibition compétitive. Clivage des épitopes glycaniques a été fait par digestion avec la section de tissu glycane enzymes spécifiques, par exemple bactérienne telle que la sialidase contrôle de liaison d'acide sialique par SNA (figure 4). Dans les cas où une enzyme spécifique (par exemple glycosidase) n'est pas disponible pour enlever l'épitope glycane étudiés, la spécificité lectine peut être confirmé par l'ajout d'un inhibiteur compétitif tel que Melibiose pour la coloration jacaline ou chitine-hydrolysat pour la coloration sWGA (figure 5). Nous démontrons ici que des échantillons de tissus congelés composant logiciel enfichable, qui sont routinely obtenu dans la clinique et dans les laboratoires de recherche, peut encore être incorporé dans un PTOM, et utilisées pour étudier glycoprotéines mucines et les glycanes de nombreux présents sur eux. Lectine / Ab Source Spécificité majeure LFA Limax flavus (limace jaune) Terminal Sia * MAA Maackia amurensis (Amour Maackia) Siaα2-3Galβ1-R / 3-O-sulfate sur Galβ1-R SNA Sambucus nigra (Sureau) Siaα2-6Gal / Siaα2-6GalNAc WGA Triticum vulgaris (germe de blé) GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc / Sia sWGA Triticum vulgaris succinylée (germe de blé) GlcNAc & beta; 1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc PNA Arachis hypogaea (arachide) Galβ1-3GalNAc (non modifiée antigène T) Jacaline Artocarpus integrifolia (jacaline) Galβ1-3GalNAc trouve sur O-glycanes CEA Erythrina cristagalli (arbre corail) Galβ1-4GlcNAc TKH2 Anticorps Siaa2-6GalNAc (STN) sur O-glycanes CA19-9 Anticorps Siaa2-3Galβ1-4 (Fuca1-3) GlcNAc (SLE a) SNH3 Anticorps Siaa2-3Galβ1-3 (Fuca1-4) GlcNAc (SLe x) Abréviations: Ab, anticorps; Sia, de l'acide sialique; Gal, Galactose; GalNAc, <em> N-acétylgalactosamine; GlcNAc, la N-acétylglucosamine; Fuc, le fucose, STN, Sialyl Tn; sLe a, sialyl Lewisa; sLe x, x sialyl Lewis. * Les sources commerciales pour MAA comprennent MALI, MALII & MAH. Tableau 1. Voici une liste partielle des lectines et anticorps pour épitopes glycanes. Figure 1. Bleu Alcian et périodique Schiff coloration acide des tissus du côlon congelées et inclus en paraffine. Coupes de tissus d'origine humaine, souris ou du côlon spécimens de poulet congelés dans l'OCT (panneau supérieur) ou inclus en paraffine (panneau inférieur) ont été colorées avec de l'acide périodique Schiff (PAS) ou Bleu Alcian (AB). Ces réactifs tache mucus rose ou bleu, respectivement. Panneau supérieur: Dans les tissus congelés, en plus de mucines dans les cellules caliciformes, le mucus sécrété était aussi visible (flèches). Panneau inférieur: Dans les tissus inclus en paraffine, coloration du mucus a été confinée aux cellules caliciformes. Les noyaux ont été contre-colorées avec Surgipath (PAS) ou Mayer (AB) hématoxyline. La barre d'échelle indique 100 um. Cliquez ici pour agrandir la figure . Figure 2. Résultats d'incubation Citrisolv une perte importante de mucines. Sections en série de spécimens congelés de poulet iléon ont été fixés dans du formol tamponné à 10% et maintenu hydraté (panneau de gauche), déshydratées dans de l'éthanol par incubation séquentielle de 70%, 90% et 100% d'éthanol pendant 20 min chacune (graphique du milieu), ou déshydratés dans l'éthanol et effacé avec Citrisolv pendant 1 heure (panneau de droite). Échantillons déshydratés ont été réhydratés retour à la PBS avant d'hématoxyline et l'éosine (H & E) ou coloration au bleu alcian. Déshydratation de l'éthanol et Citrisolv élimination de tissu amélioration morlogie (par exemple, rangée du haut, les images milieu et de droite par rapport à l'image à gauche). Déshydratation de l'éthanol n'a eu aucun effet significatif sur la coloration bleu Alcian (rangée du milieu, comparer les images gauche et du milieu). En revanche, l'incubation Citrisolv réduit la coloration au bleu Alcian et confinée à des cellules caliciformes (rangée du milieu, l'image de droite) dans un modèle qui a été similaire à celle observée dans les tissus inclus en paraffine (Figure 1). Ces données impliquent que la forte coloration des granules de mucus dans les échantillons inclus en paraffine est due à la contraction et la condensation de mucus dans les cellules caliciformes lors de l'étape de compensation. La coloration plus pâle et moins dense de mucus dans surgelés OCT-embarqués tissus reflète une répartition plus naturelle du mucus dans le tissu. Forts grossissements de zones encadrées sont marqués par des flèches. Barres d'échelle indiquent 50 pm (lignes du haut et du milieu) et 10 um (rangée du bas). Figure 3. Reliure d'lectines à épitopes glycanes sur des tissus congelés et inclus en paraffine. poulet intestin grêle (iléon) Les échantillons congelés dans l'OCT (panneaux supérieurs) ou inclus en paraffine (panneaux inférieurs) ont été sondés avec jacaline (bleu), sWGA (vert) et SNA (rouge ). Forts grossissements de zones encadrées sont marqués par des flèches. Dans les tissus congelés liaison à O-glycanes jacaline révélé des structures qui semblaient suinter de cellules caliciformes dans la lumière (jacaline, panneau supérieur, flèches). En revanche, les contraignant à paraffine tissus jacaline a été confinée aux cellules caliciformes (jacaline, panneau inférieur, flèches) et de la bordure en brosse des villosités (bas de l'image de gauche, flèche). coloration sWGA de β1-4GlcNAc partiellement co-localisée avec la liaison de la lectine jacaline dans les deux tissus congelés (panneau supérieur, flèches), et dans les tissus inclus en paraffine (en bas, flèches). En revanche, la lectine SNA liaison à α2-6 acides sialiques liés est intracellulaire (SCN, pointes de flèches), et n'est pas co-localisés avec jacaline (couleurimage, SNA en rouge marqué avec une flèche, jacaline en bleu marqué avec une flèche en pointillés). Barres d'échelle indiquent 100 um (images de gauche) et 20 um (agrandies zones encadrées). Figure 4. Contrôle de clivage enzymatique pour la coloration acide sialique avec le SCN. Échantillons de poulet intestin grêle ont été incubées avec 250 mU / ml Arthrobacter ureafaciens sialidase (AUS) ou avec 50 mM d'acétate de sodium pH 5,5 tampon pendant 2,5 h à 37 ° C. AUS traitement abolit coloration avec biotinylé SNA, ce qui confirme la spécificité de liaison SNA aux acides sialiques. La barre d'échelle indique 100 um. Figure 5. Contrôle de l'inhibition compétitive pour la coloration glycane avec jacaline et sWGA. Poulet intestin grêle (iléon) échantillons ont été incubés avec un mélange jacaline et sWGA en présence de lec spécifiqueinhibiteurs de l'étain: mélibiose (colonne du milieu), chitine-hydrolysat (colonne de droite) ou sans inhibiteur (A et D). Panneau supérieur: (à gauche) jacaline coloration sans inhibiteurs. (Au centre) jacaline coloration a été inhibée par Melibiose. (À droite) Le chitine hydrolysat n'a pas inhibé la coloration jacaline. Panneau inférieur: (à gauche) sWGA coloration sans inhibiteur. (Au centre) Melibiose n'a pas inhibé la coloration sWGA. (À droite) sWGA coloration a été inhibée par chitine-hydrolysat. Cette inhibition confirme l'interaction spécifique des lectines avec les tissus. Les astérisques marque l'image de l'inhibition de la coloration. La barre d'échelle indique 100 um. Figure 6. Détection des mucines sécrétoires, des glycolipides et des épitopes glycanes dans les tissus humains congelés cancer colorectal. Biopsies de cancer colorectal cancer villeux et le carcinome muqueux étaient composant logiciel enfichable congelés dans de l'azote liquide et intégré dans octobre Les coupes de tissus ont été incubés pendant 1 havec des anticorps contre la mucine sécrétée MUC5AC, un sialyl-Lewis – glycane épitope trouvé sur les gangliosides (cancer colorectal marqueur CA 19-9), et sialyl-Tn – abondante épitope glycannique sur mucines (détecté avec l'anticorps TKH2), suivie de 30 minutes d'incubation avec biotinylé d'âne anti-souris IgG anticorps secondaire, et 30 minutes d'incubation avec la streptavidine conjuguée à la peroxydase. D'autres tissus ont été incubés pendant 1 heure avec le SNA biotinylée lectines et sWGA, suivie de 30 minutes d'incubation avec la streptavidine conjuguée à la peroxydase. Marquage par la peroxydase a été développé en utilisant l'AEC kit. Barre d'échelle noire indique 200 um.