טיהור ויזואליזציה של Lipopolysaccharide של חיידקים גראם שליליים, על ידי הפקת מימית, פנול חם
Summary
אנו מתארים שיטה שונה חמה מימית, פנול החילוץ לטיהור lipopolysaccharide (LPS) של חיידקים גראם שליליים. חילוץ פעם, LPS ניתן לנתח לאחר מכן על ידי SDS-PAGE ו דמיינו ידי צביעה ישירה או immunoblot המערבי.
Abstract
Lipopolysaccharide (LPS) מהווה מרכיב מרכזי של גראם שליליים הקרומים החיצוניים חיידקים. זוהי מולקולה משולשת המורכבת השומנים, אשר מוטבע קרום חיצוני, ליבה oligosaccharide וחזרה O-אנטיגן יחידות להאריך החוצה מפני השטח של התא 1, 2. LPS הוא מולקולה immunodominant כי חשוב ארסיות ו בפתוגנזה של מיני חיידקים רבים, כולל Pseudomonas aeruginosa, מיני סלמונלה, אשריכיה קולי ו 3-5, וההבדלים בצורת O-אנטיגן הרכב LPS בסיס serotyping של זנים. LPS הוא מעורב מצורף לארח תאים על תחילתו של זיהום ומספק הגנה מפני הרג השלמה בתיווך, זנים חסרי LPS יכול להיות נחלש עבור ארסיות 6-8. מסיבות אלו, חשוב לדמיין LPS, בעיקר קליני מבודד. LPS חזותי שהתקבצו דפוסי הכרה על ידי ספציפיתntibodies יכול להיות כלי שימושי לזיהוי השושלות להתאמץ כדי לאפיין מוטנטים שונים.
בדו"ח זה, אנו מתארים שיטה חמה מימית, פנול עבור בידוד וטיהור של LPS של גראם שליליים תאים חיידקיים. פרוטוקול זה מאפשר מיצוי של LPS הרחק חומצות גרעין וחלבונים שיכול להפריע ויזואליזציה של LPS המתרחשת עם, שיטות קצרות יותר החילוץ פחות אינטנסיבית 9. LPS מוכן בדרך זו יכול להיות מופרדים על ידי נתרן גופרתי dodecyl (SDS), ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide (עמוד) ומוכתמת ישירות באמצעות פחמימות / גליקופרוטאין כתמים או צביעה רגילה ושיטות כסף. רבים נגד סרה כדי LPS מכיל נוגדנים צולבות להגיב עם חלבונים בממברנה החיצונית או מטרות אנטיגני אחרות שיכולות להפריע תגובתיות שנצפו בעקבות immunoblot המערבי של SDS-PAGE מופרד lysates סלולריים הגולמי. טיפול פרוטאז של lysates תא גולמי בלבד לא תמיד הדרך היעילה של הסרת זורקע שימוש או שיטות הדמיה אחרות. יתר על כן, הטיפול פרוטאז נרחב בניסיון להסיר את הרקע יכול להוביל LPS באיכות ירודה אשר לא נפתרה היטב בכל אחת מהשיטות הנ"ל. מסיבות אלו, אנו מאמינים כי הפרוטוקול הבא, עיבוד Westpahl ו ג'אן 10, הוא אידיאלי להפקת LPS.
Protocol
Discussion
תיארנו שיטה לטיהור LPS הרחק מרכיבים תאיים אחרים, כולל חומצות גרעין וחלבונים. שיטה זו מספקת באיכות גבוהה LPS כי ניתן להשתמש במספר שיטות הדמיה שונות, כולל צביעה של פחמימות SDS-עמוד ג'לים, כפי שמוצג באיור 1. שיטה זו יכולה לשמש סרוטיפ LPS ממגוון רחב של זנים, תוך שימוש ספציפי נגד…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות וקרן סיסטיק פיברוזיס.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 04716728001 |
| RNase A | Roche | 10109169001 |
| Proteinase K | Fisher | BP1700 |
| Tris-Saturated Phenol | Fisher | BP1750-100 |
| Diethyl Ether | Thomas Scientific | C313K31 |
| Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit | Molecular Probes | P20495 |
References
- Raetz, C. R., Whitfield, C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu. Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).
- Valvano, M. A. Export of O-specific lipopolysaccharide. Front. Biosci. 8, 452-471 (2003).
- Pier, G. B. Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide: a major virulence factor, initiator of inflammation and target for effective immunity. Int. J. Med. Microbiol. 297, 277-295 (2007).
- Freudenberg, M. A. Role of lipopolysaccharide susceptibility in the innate immune response to Salmonella typhimurium infection: LPS, a primary target for recognition of Gram-negative bacteria. Microbes Infect. 3, 1213-1222 (2001).
- Jann, K., Jann, B. Polysaccharide antigens of Escherichia coli. Rev. Infect. Dis. 9, S517-S526 (1987).
- McCallum, K. L., Schoenhals, G., Laakso, D., Clarke, B., Whitfield, C. A high-molecular-weight fraction of smooth lipopolysaccharide in Klebsiella serotype O1:K20 contains a unique O-antigen epitope and determines resistance to nonspecific serum killing. Infect. Immun. 57, 3816-3822 (1989).
- Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis: a class of serum-sensitive, nontypable strains deficient in lipopolysaccharide O side chains. Infect. Immun. 42, 170-177 (1983).
- Gupta, S. K., Masinick, S., Garrett, M., Hazlett, L. D. Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide binds galectin-3 and other human corneal epithelial proteins. Infect. Immun. 65, 2747-2753 (1997).
- Hitchcock, P. J., Brown, T. M. Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels. J. Bacteriol. 154, 269-277 (1983).
- Westphal, O., Jann, K. Bacterial lipopolysaccharides. Methods Carbohyr. Chem. 5, 83 (1965).
- Lieberman, T. D. Parallel bacterial evolution within multiple patients ties novel genes to pathogenesis. Nat Genet. , (2011).
