פוליוויניל אלכוהול ספוג דגם השרשה
Summary
כלי שימושי כדי לנתח את ההשפעות של תרופות, גורמי גדילה, ו / או תאים מניפולציות במודל חיה של תיקון הפצע מתואר. שיטה זו מנצלת את המאפיינים של ספוג אלכוהול (PVA) פוליוויניל לספק ולהכיל את הטיפול הרצוי וגם לתת במה שיש נכרת ונותחו.
Abstract
ריפוי הפצע הוא תהליך מורכב, רב שלבי מעורבים סוגי תאים רבים, גורמי גדילה ותרכובות 1-3. בגלל המורכבות הזאת, המחקרים ריפוי הפצע הם המקיף ביותר כאשר בוצע in vivo. יש הרבה מודלים זמינים ב vivo ללמוד ריפוי פצעים חריפה, כולל incisional שטח, excisional מת, וכוויות. מודלים שטח מת הם מלאכותיים, שתלים נקבוביים המשמשים ללמוד היווצרות רקמות ההשפעות של חומרים על הפצע. כמה דגמים נפוצים כוללים שטח מת פוליוויניל אלכוהול (PVA) ספוגים, תיל פלדה צילינדרים רשת, הרחיבה חומר polytetrafluoroethylene (ePTFE), ו 1,2 Cellstick.
כל דגם שטח מת יש מגבלות משלה המבוססים על הרכב החומר של שיטות ההשתלה שלו. תיל פלדה רשת דגם גליל יש שלב השהיה של הסתננות לאחר ההשתלה דורש כמות ארוכה של זמן עד היווצרות רקמות פרור begiNS 1. בשלבים מאוחרים יותר של ריפוי פצעים מנותחים הטוב ביותר באמצעות מודל 1,4 ePTFE. Cellstick הוא ספוג תאית בתוך המודל צינורית סיליקון אשר משמש בדרך כלל לחקר פצעי הניתוח האדם בסופו של נוזלים 2. ספוג PVA מוגבלת מחקרים חריפה כי עם הזמן הוא מתחיל לעורר תגובת גוף זר הגורם התגובה תא ענק חיה 5. שלא כמו חומרים אחרים, ספוגים PVA קל להוסיף ולהסיר, עשויים מחומרים אינרטיים ולא מתכלה ועם זאת רכים מספיק כדי להיות מחולק לניתוח היסטולוגית 2,5.
בתוך הפצע לריפוי ספוג PVA הוא מאוד שימושי עבור ניתוח רקמות היווצרות פרור, בתצהיר קולגן, נוזל הרכב הפצע, את ההשפעות של חומרים על תהליך הריפוי 1,2,5. בנוסף השימוש בו לומדים מגוון רחב של תכונות של ריפוי פצעים, ספוג PVA כמו כן נעשה שימוש בסוגים רבים אחרים של מחקרים. זה חכמו נוצלו לחקור אנגיוגנזה הגידול, החדרת תרופות בתאי גזע הישרדות engraftment 1,2,6,7. עם alterability הרבה, שימוש רב מראש, והתוצאות לשחזור, ספוג PVA הוא מודל אידיאלי 1,2 מחקרים רבים.
כאן, נתאר, הכנת ההשתלה ואחזור של דיסקים PVA ספוג (איור 1) במודל של עכברים של ריפוי הפצע.
Protocol
1. ספוג הכנה ספוגים מימה על ידי ערבוב בין לילה ב% 0.9 (W / V) בתמיסה מימית נתרן כלורי. לעקר ספוגים hydrated ידי מעוקר אותם. החיטוי של 75 מ"ל, במשך 25 דקות ב 121 ° C. הערה: ספוגים טוען עם הטיפול כפי שיפורט בהמשך הוא אופציונלי. בשכונה סטרילי עם מכשירים סטריליים, לקחת את אחד ספוג מפתרון באמצעות פינצטה. לסחוט את הספוג עם פינצטה את ולהשתמש עצה ואקום להסיר הפתרון ככל האפשר מן הספוג. מניחים את סחטה ספוג בצלחת תרבית רקמה, נזהרת להשאיר רווח בין ספוגים. גם הצלחות מרובות ניתן להשתמש כדי להפריד בין טיפולים שונים. פיפטה פתרון טיפול ישירות על גבי במרכז ספוג. לחצו בעדינות על ספוג עם קצה פיפטה אחרי הפתרון הושם על ספוג, זה עוזר ספוג לקלוט את הפתרון. הערה: 6 מ"מקוטר של 2.75 מ"מ ספוגים עבים שאנחנו מעסיקים מסוגלים להכיל עד 25 μL. לאחר כל ספוגים נטענים, צלחת הם יכולים להיות מאוחסנים על הקרח עד שהם מושתלים העכבר. 2. נוהל כירורגי כראוי להרדים חיות ולנהל מנע כאבים. התהליך כולו יימשך כ 20 דקות לכל בעל חיים. במשך 30 גרם 1.5 ליטר עכבר בדקה של חמצן עם 1.5% Isoflurane משמש כדי לעורר ולשמר הרדמה. כאשר בעל החיים אינו מגיב במבחן קמצוץ רפלקס, מקום חרוט האף במצב שכיבה. להשתמש במכונת גילוח חשמלית לגלח 1 פנימה על ידי 1 פנימה לאזור בצד הגחון נמוך מתחת לכלוב הצלעות. נגב נקי של שיער קצוץ. לחטא את האזור מגולח על ידי ניקוי בבטאדין ואחריו אלכוהול 70%. חזור על טיהור בבטאדין אלכוהול שלוש פעמים. תוך כדי לחיצה העור לימד, השתמש אזמל לעשות חתך אנכי 1.5-2 פעמים Diaמטר של ספוגים כדי להיות מוכנס, להיות זהירים לא לחתוך דרך חלל הגוף. השתמש כמה פינצטה להחזיק את הקצה של העור ולאט לאט מתחילים להפריד את העור שרירים משני צידי החתך באמצעות מספריים Metzembaum. כיס צריך ללכת לרוחב של העכבר ומתוך כלוב הצלעות על הרגליים האחוריות. השתמש כמה פינצטה להרים את הספוג 1 להציב חיה על ידי צובט אותה הצדדים. להעביר את הספוג על כמה פינצטה ישרים כך מוחזק מהחלק העליון והתחתון. להשתמש בפינצטה כדי להחזיק את הקצה של העור ולהרים אותו כך את הספוג יכול להיות מוכנס. לאט לאט להכניס את הספוג מנסה להימנע מלגעת העור או השרירים שמתחת כמו ספוג יהיה קשה לעבור את זה פעם אחת נגע רקמות. חזור על הפעולה עבור כל ספוגים. לאחר כל ספוגים היה מוכנס, במקום שניים או שלושה תפרים כדי לסגור את החתך. השתמש פינצטה להחזיק את שני הצדדים של החתך יחד חוט sutu מחדש באמצעות שתי שכבות של עור. להדק לזרוק 1 מספיק כדי לסגור את הקצוות העור. לסיים את הקשר מרובע עם עוד לזרוק מהכיוון השני, הפעם משיכת קשר הדוק. ואז לקשור שני קשרים יותר רבועים לסיים תפר (איור 2). מניחים התפרים נוספות כדי לסגור את החתך כולו. אחרים מליטה שיטות הפצע ניתן להשתמש כגון dermabond, קליפים הפצע, או סיכות. הסרה של בעלי חיים ממערכת הרדמה ולנטר תוך התודעה יתחדש. בעלי חיים צריך להתחיל מהר ambulating ולחזור ניידות מראש אופ. להבטיח כי הם יכולים להגיע מספיק מזון ומים. מעט מזון לח עשוי להיות ממוקם בתחתית הכלוב כדי לסייע להחלמה. להמשיך ולעקוב אחר בעלי חיים מדי יום בחיפוש אחר סימנים של מצוקה או אי נוחות, ולבדוק את האתר החתך על, זיהום בקיעה דלקת. קח את הפעולה המתאימה אם סיבוכים עד להחלמה נמצאים. 3. אופציונלי הזרקת <p cילדה = "jove_content"> הערה: לאחר ספוגים היו מושתלים לתוך חיים שהם יכולים להיות מוזרק עם תמיסה של תאים, תרופות, גורמי גדילה וכו 'זה מאפשר ניתוח של ההשפעות של החומר המוזרק במהלך זמני אספקה מגוונים ומנהל משטרים. אם זריקות מתבצעים השליטה יש להשתמש תמיד. להזריק את הספוג עם פתרון הרצוי, 1 לקבוע את כמות החומר לנהל את העכבר. החומר צריך להיות מרוכז כל כך את עוצמת הזריקה היא פחות ממחצית הנפח הכולל ספוג יכול להכיל. להכין מזרק להזרקה (על עכברים בהם אנו משתמשים מחט 28 G). מניחים את בעלי החיים כדי לקבל את זריקות הרדמה. כאשר בעל החיים כבר לא מגיב למבחן קמצוץ ההזרקה יכולה להינתן. כדי לתת זריקת לדחוף את המחט על העור 45 ° זווית יסודי במרכז ספוג. ואז לדחוף את המחט אל תוך הספוג רק הולך חצי דרךדרך עובי שלה. המטרה היא להזרים למרכז המדויק של הספוג. כדי לבדוק כדי לוודא שהמחט נמצאת ספוג, לאט להרים את המחט בצורה אנכית. אם המחט הוא ספוג, ספוג צריך לעלות עם המחט. לאט לאט להזריק לתוך הספוג ולהסיר את המחט. אם יש ספוגים רבים המחייבים זריקות יתכן כי חלק הנוזל מוזרק יהיה דחף את האתרים קודמות של ההזרקה. 4. ספוג להסרת הערה: במהלך הסרת ספוג, ספוג להתמודד עם משנה זהירות. למנוע חדירה ספוג עם מכשירי ניתוח ומניעת דימום יתר לתוך הספוג על ידי הימנעות העורקים הגדולים סביב הרקמה הסובבת. אחרי החיה היא המתת חסד, להסיר את הספוג על ידי לחיצה העור באמצעות כמה פינצטה ועושה חתך לסגור את הספוג. בזהירות להפריד בין ספוגים מן הקפסולה מסביב ND למנוע קצירת רקמה נוספת סביב הספוג. מבחני כגון משלוח סמים או morphometry, דיוק פחות נדרשת כריתה. 5. נציג תוצאות ספוגים שהוסרו ניתן לאחסן בתנאים שונים בהתאם לסוג הניתוח הזה יבוצע. עבור חתך, ספוגים את שאוחזרו יכול להיות מוטבע בינוני על הקפאת כגון טמפרטורה אופטימלית חיתוך מתחם (אוקטובר) או להציב 10% פורמלין להטבעת ו חתך בבלוקים פרפין (איור 3 א 'וב'). התוצאות הטובות ביותר עבור חתך מתקבלים כאשר ספוג נחתך במחצית פני בקוטר ומוטבעים לחתוך את פני השטח (איור 4 א 'וב'). קטעי ספוג צריך לקחת כל כך לכל רוחב הספוג הוא ההווה. איור 3 א מציג שני ספוגים, ספוג השמאלית מוטבע / מחולק בצורה לא נכונה ו ספוג הנכון היה מעובד כראוי. אף אוזן גרון "> לניתוח, ספוגים ניתן לשים צינור Eppendorf ומאוחסנים ב -20 ° C עד מוכן עיבוד RNA כמותי בזמן אמת ה-PCR ספוגים ניתוח צריך להיות ממוקם בתוך צינור Eppendorf, פלאש קפוא, ומאוחסנים ב. – 80 ° C. בנוסף, חומר משמר RNA, כמו RNAlater מ QIAGEN, ניתן להשתמש בהם כדי לייצב את RNA לאחסון בטוח בטמפרטורות גבוהות. נוזל פצע ניתן לאסוף על ידי כיווץ את ספוגים מעל הצינור, וצירוף יחד נוזל ספוגים מרובים כדי להשיג מדגם מייצג. תאים חיים, כגון מקרופאגים, פיברובלסטים ו לימפוציטים, ניתן להפיק את ספוגים. לאחר הסרת מבעל חיים, ספוגים יכול להיות מקום כ המדיה המתאימה לסוג הרצוי של תאים. ספוגים יכול להיות מעובד לשחרר את התאים על ידי פיזיים (כלומר collagenase) שיטות (כלומר מתייפייף) או אנזימטי. באיור 1. Dehydraטד PVA ספוג דיסקים בשלושה גדלים שונים. איור 2. תמונה של מודל העכבר ריפוי הפצע מראה המיקום של הפצע לרוחב וארבעה ספוגים PVA. איור 3. (א) H & E מכתים ב 4x ו (ב) מכתים Trichrome בהגדלה של 10X של ספוגים פרפין מחולקות למדורים משובצים. באיור 4. (א) תמונה של חתך ספוג במחצית לאורך הקוטר. (ב ') 1/2 PVA ספוג, מוטבע לחתוך בצד למטה אוקטובר
Discussion
<p class="jove_content"> מודל ספוג של ריפוי פצעים יש וריאציות רבות: היא יכולה להתבצע מינים שונים רבים, כולל בני האדם ואת ספוגים יכול גם להיות מושתל dorsally<sup> 1,2,8</sup>. למחקרים בבני אדם וכמה מינים אחרים, ספוגים ייתכן שיהיה צורך להציב צינורות סיליקון נקבובי כדי למנוע את הספוג מלהיות במארז ולאפשר הקלות של הסרת<sup> 4,8</sup>. המיקום של ההשתלה את הספוג ניתן לשנות על פי התוצאות הרצויות והמיומנות של הטכנאי. השתלת הגבי יכולים להרשות ספוגים לנוע מתחת לעור, ואילו שתלים הגחון קשה יותר עקב ההסתברות של חיתוך דרך חלל הבטן. ספוגים ניתן להגדיר עם קטטר כדי החדרת תרופות קבוע ומבוקר, ביטול הצורך זריקות מרובות<sup> 9</sup>. קטנים יותר, ספוגים צינורי יכול אפילו להיות מוזרק באמצעות מחט<sup> 8</sup>. הרכב של ספוגים לא רק אלכוהול פוליוויניל בלבד. הם יכולים להיות מוכנים מחומרים רבים באופן בלעדי או בשילוב<sup> 7</sup>.</p><p class="jove_content"> חשוב מאוד להכנת ספוג והמיקום של בעל החיים כדי להיות עקביים הובנו כראוי. אם ספוגים נחתכים מתוך גליונות הם חייבים להיות משקל דומה להשוואה. אם הספוג הוא להיות טעון עם תאים או טיפול, כמות להציב ספוג זה חייב להיות מדויק. תהליך ההחלמה יכול להשתנות בהתאם למיקום של המיקום של הספוג של בעלי חיים וריפוי תקטין את המרחק מן העליות ראש<sup> 1,10</sup>.</p>
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
במימון מכוני הבריאות הלאומיים (NIH) מענק R01-HL088424; לענייני יוצאי צבא פרס הוקרה PPy.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue number | Comments |
| PVA Sponge | Medtronic | CF120 | The size and porosity of the sponge depends on the experiment |
| Scalpel blade size 15 | BD Medial | 371115 | |
| Metzembaum scissors | Thermo Scientific | 79-211 | |
| Hemostat Forceps | Fine Science Tools | 13004-14 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12004-16 | |
| 5-0 nylon suture | Ethilon | 698 | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 |
References
- Efron, D. T., Barbul, A. Subcutaneous sponge models. Methods Mol. Med. 78, 83-93 (2003).
- Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair. 8, 83-96 (2000).
- Sprugel, K. H., McPherson, J. M., Clowes, A. W., Ross, R. Effects of growth factors in vivo. I. Cell ingrowth into porous subcutaneous chambers. Am. J. Pathol. 129, 601-613 (1987).
- Alaish, S. M. Comparison of the polyvinyl alcohol sponge and expanded polytetrafluoroethylene subcutaneous implants as models to evaluate wound healing potential in human beings. Wound Repair. 3, 292-298 (1995).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch. Dermatol. Res. 290, 1-11 (1998).
- Alfaro, M. P. sFRP2 suppression of bone morphogenic protein (BMP) and Wnt signaling mediates mesenchymal stem cell (MSC) self-renewal promoting engraftment and myocardial repair. J. Biol. Chem. 285, 35645-35653 (2010).
- Andrade, S. P., Ferreira, M. A. The sponge implant model of angiogenesis. Methods Mol. Biol. 467, 295-304 (2009).
- Diegelmann, R. F., Lindblad, W. J., Cohen, I. K. A subcutaneous implant for wound healing studies in humans. J. Surg. Res. 40, 229-237 (1986).
- Efron, D. T., Most, D., Shi, H. P., Tantry, U. S., Barbul, A. A novel method of studying wound healing. J. Surg. Res. 98, 16-20 (2001).
- Lindblad, W. J. Considerations for selecting the correct animal model for dermal wound-healing studies. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 1087-1096 (2008).
Citer Cet Article
Deskins, D. L., Ardestani, S., Young, P. P. The Polyvinyl Alcohol Sponge Model Implantation. J. Vis. Exp. (62), e3885, doi:10.3791/3885 (2012).