Einsatz von künstlichen Sputum Mittlere bis antibiotische Wirkung gegen die getestet<em> Pseudomonas aeruginosa</em> AGB in einen engeren Bezug zu den Mukoviszidose-Lunge

1. Herstellung künstlicher Sputum Medium (ASM) 4 g DNA aus Fischsperma bis 250 ml sterilem Wasser sehr langsam über einen Zeitraum von mehreren Stunden. Die DNA dauert mehrere Stunden, um vollständig zu lösen und kann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt werden. 5 g Muzin aus Schweinemagen (Typ II) langsam auf 250 ml sterilem Wasser, bis das Mucin vollständig gelöst ist. Die Lösung kann über Nacht bei 4 ° C gerührt werden 0.25 g jeder essentiellen und nicht-essentielle L-Aminosäure, mit Ausnahme von L-Tyrosin und L-Cystein, in 100 ml sterilem Wasser. 0.25 g L-Cystein in 25 ml 0,5 M Kaliumhydroxid (M r 56,11 g / mol) und 0,25 g L-Tyrosin in 25 ml sterilem Wasser. Man löst 5,9 mg Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA), 5 g NaCl und 2,2 g KCl in 100 ml sterilem Wasser. Kombinieren Sie die DNA, Mucin, L-Aminosäuren, DTPA, NaCl und KCl in einem 1-Liter-Flasche. 5 ml Eigelb Emulsion und Füllung auf etwa 850 ml mit sterilem Wasser. Der pH-Wert auf 6,9 mit 1 M Tris (pH 8,5; M r 121,14) und bringe das Volumen auf 1 Liter mit sterilem Wasser. Sterilisieren Sie die ASM durch Filtration mit einem Vacuubrand ME 2 Membran-Vakuumpumpe und Millipore Steritop Filtereinheiten mit einem Poren-und Hals-Größe von 0,22 um und 45 mm. Jeder Steritop Filtereinheit kann sofort werden bis zu dreimal wieder verwendet, allerdings müssen die Filter zweimal mit sterilem Wasser gespült werden, bevor sie erneut verwendet. Die Filtration ist langsam und kann über 2 Tage durchgeführt werden. Andere Versionen von ASM entwickelt worden sind, dass mit der Zugabe von Antibiotika statt Filtration 11 jedoch aufgrund möglicher Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten, empfehlen wir nicht die Methode für diese spezielle Anwendung. Ungefilterten und gefilterten ASM sollte bei 4 ° C im Dunkeln gelagert werden. Mit frischen ASM wird jedoch empfohlen, kann es unter diesen Bedingungen für maximal 1 Monat aufbewahrt werden. </li> 2. Bestimmung der planktonischen Sessile Zelle Minimum Metabolic Hemmkonzentration (PSMIC) Um die minimale metabolische Hemmkonzentration (PSMIC) Werte für 15 planktonically gewachsen P. bestimmen aeruginosa-Isolate, die Mikrodilutionsmethode sollte durchgeführt werden, wie in den Richtlinien der British Society for Antimicrobial Chemotherapy BSAC 12 beschrieben. Das Antibiotikum der Wahl, in diesem Fall Tobramycin Sulfat, wird seriell in Luria-Bertani (LB)-Medium in einer 96-Well-Mikrotiterplatten zur einen geeigneten Bereich von Antibiotikum-Konzentrationen bereitzustellen verdünnt. Verdünnen Sie Übernacht-Kulturen von P. aeruginosa in LB zu einer OD 600 von 0,05 (± 0,01) und 100 ul in die Vertiefungen der 96-Well Mikrotiterplatte mit 100 ul der seriell verdünnt Antibiotikum. In diesem Fall liegt die Endkonzentrationen von Tobramycin Sulfat zwischen 512 bis 0,5 g / ml. Acht Wiederholungen jeder antibiotic Konzentration durchgeführt werden. Negative Kontrolle Vertiefungen für jede zu isolieren eingerichtet werden, in denen keine Antibiotika zugesetzt wird. Auch sollte acht Vertiefungen enthalten nur LB für die Verwendung als Rohling während Downstream-Analyse (Abschnitt 2.6). Inkubieren Sie die 96-well Mikrotiterplatten für 1 – 2 Tage bei 37 ° C ohne Schütteln unter aeroben oder mikroaerophile (5% O 2, 10% CO 2, und 85% N 2) Bedingungen. Mikroaerophilen Bedingungen werden mit Hilfe CampyGen Gaserzeugung in großen Packungen Anaerobentopf. Nach der Inkubation wird das Bakterienwachstum durch Messung der Absorption der Bakterienkultur in jeder Vertiefung bei einer Wellenlänge von 600 nm unter Verwendung eines Fluostar Omega Mikroplatten-Lesegerät und dem MARS-Datenanalyse-Software bestimmt. Die Resorption aus Antibiotika-behandelten Kulturen planktonischen (A Antibiotikum behandelt planktonischen Zellen) und die Absorption von den negativen Kontrollen (Negativkontrolle) sollte durch Subtrahieren korrigiert werdenIon der Hintergrundabsorption aus den Vertiefungen mit LB nur (Eine leere) erhalten. Die prozentuale Hemmung der Lebensfähigkeit wird anschließend als (Mittelwert ± Antibiotikum behandelt planktonischen Zellen / bedeuten eine negative Kontrolle) x 100% berechnet. Die PSMIC 90 wird wie das Antibiotikum Konzentration, die 90% ige Hemmung der planktonischen Bakterienwachstum definiert. Um die Lebensfähigkeit von Bakterien nach der Behandlung mit dem Antibiotikum der Wahl, 10 ul von 0,02% (v / v) Resazurin (verdünnt in destilliertem Wasser) wird in jede Vertiefung gegeben und die Platten werden unter aeroben Bedingungen inkubiert für 1 zu bestimmen – 2 h bei 37 ° C, unter Schütteln bei 150 UpM. Lebensfähige Zellen wird die blaue Farbstoff Resazurin dem rosa fluoreszierenden Resorufin Form zu reduzieren. Nach der Inkubation mit Resazurin, die Überwachung der Fluoreszenz von jeder Vertiefung mit einer Anregungswellenlänge von 540 nm und einer Emissionswellenlänge von 590 nm in einem Fluostar Omega Mikroplatten-Lesegerät. Die Daten sollen analysiert werden wie folgt beschrieben werdenniedrig. 3. Bestimmung der Biofilm Sessile Handy minimalen Hemmkonzentration (BSMIC) Übernacht-Kulturen von P. aeruginosa (in diesem Fall 15 Isolate von P. aeruginosa) gesetzt werden sollen in LB zu einer OD 600 von 0,05 (± 0,01), dann weiter verdünnt 1:100 in frische ASM verdünnt werden (Gesamtvolumen 1,8 ml). Die verdünnten Kulturen (1,8 ml) ist in jede Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatten behandelte Platte zugegeben werden. Drei Brunnen sollte nur für den Einsatz als Rohling während Downstream-Analyse (Abschnitt 3.9) ASM. Sichern Sie die 24-Well-Platten mit Parafilm Labor und Inkubation für 3 Tage unter aeroben oder mikroaerophilen Bedingungen bei 37 ° C unter Schütteln bei 75 Umdrehungen pro Minute. Mikroaerophilen Bedingungen sollte unter Verwendung CampyGen Gaserzeugung in großen Packungen Anaerobentopf werden. Verdünnte das Antibiotikum der Wahl, in diesem Fall Tobramycin Sulfat, um eine geeignete Konzentrationsbereich in frischem bereitzustellenASM. In diesem Fall lag Endkonzentrationen zwischen 512 bis 1 g / ml. Fügen Sie jede Konzentration des Antibiotikums, die in Mengen von 200 ul, in die entsprechenden Vertiefungen der 24-Well-Platten. Vier Replikate von jedem Antibiotikum-Konzentration durchgeführt werden. Biofilme nicht das Antibiotikum der Wahl ausgesetzt wurden als negative Kontrolle verwendet. Sichern Sie die 24-Well-Platten mit Parafilm Labor und inkubieren unter aeroben oder mikroaerophilen Bedingungen für weitere 24 h bei 37 ° C unter Schütteln bei 75 Umdrehungen pro Minute. Nach der Inkubation in der Gegenwart des Antibiotikums der Wahl, Störung der bakteriellen Biofilmen unter Verwendung von 100 ul 100 mg / ml Cellulase (verdünnt in 0,05 M Citratpuffer [9,6 g / l Citrate.H 2 0 in Wasser und pH auf 4,6 mit NaOH] ) und Inkubieren der Platten mit 24 Vertiefungen unter aeroben Bedingungen bei 37 ° C unter Schütteln bei 150 Upm während 1 h. Bei Bedarf könnten weitere Biofilmen durch manuelles Pipettieren werden in dieser Phase gestört. Um die metabolischen Aktivitäten bestimmender Bakterienzellen aus den aufgebrochenen Biofilmen freigesetzt, 100 ul von 0,02% (v / v) Resazurin (verdünnt in destilliertem Wasser) sollte zu jeder Vertiefung der 24-Well-Platten gegeben werden und für 1 – 2 h bei 37 ° C unter Schütteln bei 150 Upm. Nach der Inkubation mit Resazurin, die Fluoreszenz von jeder Vertiefung mit einer Anregungswellenlänge von 540 nm und einer Emissionswellenlänge von 590 nm in einem Fluostar Omega Mikroplatten-Lesegerät und dem MARS-Datenanalyse-Software. Fluoreszenz von den Antibiotika-behandelten Biofilme (F Antibiotikum behandelten Biofilme) und die Fluoreszenz von den negativen Kontrollen (F negative Kontrolle) sollte durch Subtraktion der Hintergrund-Fluoreszenz von den Vertiefungen, die ASM erhalten korrigiert werden nur (F frei). Die prozentuale Hemmung der Lebensfähigkeit wird anschließend als (Mittelwert von F Antibiotikum behandelt Biofilmen / F bedeuten negative Kontrolle) x 100% berechnet. Die BSMIC 90 wird wie der antibio definierttic Konzentration, die 90% ige Hemmung der Stoffwechselaktivität. 4. Repräsentative Ergebnisse ASM Biofilmbildung in kleinen (2 ml) sind möglich und die Biofilme sind vollständig innerhalb von 3 Tagen (1A) gebildet ist. Dies kann durch eine konsequente Pipettieren den Biofilm, die nur schwer zu stören sollten aufgezeigt werden. Die Mikrokolonien sind vergleichbar mit denen in größeren Volumina 4 (Abbildung 1B) gewachsen. Abbildung 2 zeigt große Unterschiede zwischen den Zellen planktonically und in einem Biofilm als durch elektronenmikroskopische Bild-Analyse nachgewiesen gewachsen. Biofilm Kulturen zeigen deutlich erhebliche Ebenen der extrazellulären Matrix und die Zellen umgebende einzelnen Strukturen innerhalb des Biofilms sind schwer zu identifizieren. Mehrere Studien legen nahe, dass der Biofilm Lebensstil kann antimikrobiellen Empfindlichkeit 13, 14 auswirken. Unsere Kleinen ASM Test kann verwendet werden, um Dete werdenrmine die BSMIC mehrerer Antibiotika für mehrere Isolate zur gleichen Zeit. Der Workflow des Assays ist in Abbildung 3 dargestellt. Die Wirkung von Antibiotika auf bakterielle Lebensfähigkeit der Zellen kann gemessen unter Verwendung des Resazurin-Assay werden. Antibiotika, in diesem Fall Tobramycin, kann der etablierten Biofilm hinzugefügt und inkubiert für 24 Stunden. Danach wird der Biofilm gestört wird und Resazurin zugegeben. Metabolisch aktiven Zellen verringern kann die Farbstoff Resazurin was zu einem Farbumschlag von blau (Resazurin) in pink (Resorufin) 15. 4A zeigt ein Beispiel Test, bei dem P. aeruginosa wurde mit verschiedenen Konzentrationen von Tobramycin, bevor Biofilm Störungen und Zugabe von Resazurin in einer Mikrotiterplatte inkubiert. Die nicht-fluoreszierenden blauen Farbe zeigt an, nicht lebensfähige Zellen, während die lebensfähigen Zellen reduzieren den Farbstoff an den rosa fluoreszierenden Form, Resorufin. Der SMIC kann dann durch Umwandlung von Fluoreszenz in Prozent berechnet werdenverbleibenden Lebensfähigkeit der Bakterien. 4B zeigt die Veränderung in% Lebensfähigkeit mit zunehmender Konzentration Tobramycin. 10% Lebensfähigkeit wurde als Hell-Dunkel-gewählt, um die SMIC 90 zu berechnen. Unter aeroben Bedingungen sind die Tobramycin SMIC 90-Werte höher als Biofilm-Zellen sind als die der planktonischen gezüchtet. Tabelle 1 zeigt die Variation in PSMIC 90 und 90 BSMIC für alle Isolate getestet. Tabelle 2 zeigt, dass unter aeroben Bedingungen, ein dramatischer Anstieg der Resistenz gegen Tobramycin (2 bis> 32 fache Erhöhung der SMIC) für die meisten Isolate wurde beobachtet, wenn in ASM (Biofilm-Modus) im Vergleich zu LB (Plankton-Modus) gewachsen. Zusätzlich zeigten Biofilme unter mikroaerophilen Bedingungen gezüchtet eine erhöhte SMIC zwischen 2 und> 128-fache an, wenn von Biofilmen unter aeroben Bedingungen angebaut werden. Abbildung1. Biofilmbildung von P. aeruginosa in ASM P. aeruginosa Stamm PAO1 bildet makroskopisch sichtbare Klumpen (Mikrokolonien), wenn in ASM gewachsen. A, Biofilmbildung in 30 ml Kulturen ASM (Groß-) nach 7 Tagen Wachstum in Schraubverschluss Glas Duran Flaschen. B, Biofilm-Bildung in 2 ml ASM Kulturen ( kleinräumige) nach 3 Tagen Wachstum in 24-Well-Polystyrol-Platten. Abbildung 2. TEM-Aufnahmen von Biofilmen ASM A / C TEM-Aufnahme (x; 27.000) von PAO1 planktonically gewachsen und in ASM bzw. B / D TEM-Aufnahme (x57, 000) von PAO1grown planktonischen und in ASM bzw.. Planktonically gewachsenen Bakterien wurden über Nacht in LB-Medium kultiviert. Biofilme wurden 7 Tage lang in 30 ml ASM Kulturen angebaut. Schwarze Pfeile beziehen sich auf Zellen innerhalb des Biofilms und die Sterne beziehen sich auf extrazellulären Raum. Maßstabsbalken = 1um. Abbildung 3. Workflow des ASM Biofilm antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung Assay. Abbildung 4. Verwendung Resazurin zur Bestimmung der MHK Bakterielle Zellen mit verschiedenen Konzentrationen des Antibiotikums und der verbleibende metabolische Aktivität wurde unter Verwendung Resazurin inkubiert wurden. A, zeigt die blaue nicht-fluoreszierenden oxidierte Form von Resazurin nicht lebensfähigen Zellen und wird durch metabolische verringert aktive Zellen zu pink fluoreszierenden Resorufin. B wird die Fluoreszenz-Intensität in den Prozentsatz der verbleibenden Lebensfähigkeit der Bakterien umgewandelt. 10% Lebensfähigkeit wurde als Cut-off gewählt, um die MSMIC90 berechnen. Klicken Sie hier um lar sehenger Figur. </span> Die Stämme PSMIC 90 (pg / ml) 1 BSMIC 90 (pg / ml) 1 Aerob Microaerophilic 2 Aerob Microaerophilic 2 PAO1 4 4 8 > 512 Liverpool Epidemic Strain (LES) isoliert LESB58 21 8 64 64 128 LES400 22 32 128 8 256 LESB25 16 32 256 512 LESB55 16 64 64 > 512 LESB64 16 64 > 512 > 512 LES431 22 4 8 32 > 512 LESB49 16 64 64 256 LES109 32 128 32 > 512 Non-LES-Isolate 49461 16 32 16 > 512 59032 0,5 2 4 > 512 59073 > 512 > 512 > 512 > 512 59076 16 32 32 > 512 </Td> 27 8 16 4 > 512 45 16 32 4 > 512 Tabelle 1. Die Anfälligkeit von P. aeruginosa zu Tobramycin. 1 Zur Bestimmung der PSMICs und BSMICs Tobramycin wurde in 2-fache serielle Verdünnungen verwendet reicht von 512 bis 0,5 pg / ml (n = 8 für jede Konzentration) und 512 bis 1 pg / ml (n = 4 für jede Konzentration) verbunden sind;; PSMICs wurden unter Verwendung des Standard Mikrodilutionsmethode 1. 2 mikroaerophilen Bedingungen waren 5% O 2, 10% CO 2, und 85% N 2. Belasten PSMIC 90/90 BSMIC fache Änderung 1 PSMIC aeroben → PSMIC mikroaerophile BSMIC aeroben → BSMIC mikroaerophile PSMIC aeroben → BSMIC aeroben PSMIC mikroaerophile → BSMIC mikroaerophile PAO1 0 > 64 2 128 LES-Isolate LESB58 8 2 8 2 LES400 4 32 0,25 2 LESB25 2 2 16 16 LESB55 4 > 8 </td> 4 > 8 LESB64 4 ND > 32 > 8 LES431 2 > 16 8 > 64 LESB49 4 4 4 4 LES109 4 16 0 > 4 Non-LES-Isolate 49461 2 > 32 0 > 16 59032 4 > 128 8 > 256 59073 ND ND ND ND 59076 2 > 16 </td> 2 > 16 27 2 > 128 0,5 > 32 45 2 > 128 0,25 > 16 Tabelle 2. Fache Änderung der PSMICs und BSMICs zu Tobramycin. 1 ND, nicht bestimmt; Werte in Fettschrift zeigen SMIC fache Veränderungen> 10.