L'utilisation de moyen d'expectoration artificielle pour tester l'efficacité des antibiotiques contre<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Dans des conditions plus pertinents à la fibrose kystique du poumon

1. Préparation du milieu de crachats artificielle (ASM) Ajouter 4 g d'ADN à partir de sperme de poisson à 250 ml d'eau stérile très lentement sur une période de plusieurs heures. L'ADN prend plusieurs heures pour dissoudre complètement et peut être agité pendant une nuit à température ambiante. Ajouter 5 g mucine de porcins estomac (type II) lentement à 250 ml d'eau stérile jusqu'à ce que la mucine est complètement dissous. La solution peut être agité pendant une nuit à 4 ° C. Dissoudre 0,25 g de chaque essentiels et non essentiels L-aminoacide, à l'exception de L-tyrosine et L-cystéine, dans 100 ml d'eau stérile. Dissoudre 0,25 g de L-cystéine dans 25 ml d'hydroxyde de potassium 0,5 M (M r 56,11 g / mole) et 0,25 g de L-tyrosine dans 25 ml d'eau stérile. Dissoudre 5,9 mg d'acide diéthylènetriaminepentaacétique (DTPA), 5 g de NaCl et 2,2 g de KCl dans 100 ml d'eau stérile. Moissonneuse l'ADN, mucine, L-acides aminés, le DTPA, NaCl et KCl dans une bouteille 1 litre. Ajouter 5 ml de jaune d'oeuf emulsion et de remplissage à environ 850 ml avec de l'eau stérile. Ajuster le pH à 6,9 avec 1 M de Tris (pH 8,5, M r 121.14) et porter le volume à 1 litre avec de l'eau stérile. Stériliser l'ASM par filtration en utilisant une Vacuubrand ME 2 pompe à vide à membrane et Millipore unités Steritop filtre avec une taille de pores et le cou de 0,22 pm et 45 mm, respectivement. Chaque unité Steritop filtre peut être réutilisé immédiatement jusqu'à trois fois, cependant, les filtres doivent être rincés deux fois avec de l'eau stérile avant de les réutiliser. Le processus de filtration est lente et peut être réalisée sur 2 jours. D'autres versions de l'ASM ont été développés qui utilisent le plus d'antibiotiques au lieu de filtration 11 Cependant, en raison des interactions médicamenteuses possibles, nous ne recommandons pas la méthode pour cette application particulière. Non filtrée et filtrée ASM doivent être conservés à 4 ° C dans l'obscurité. Utilisation de frais ASM est toutefois recommandé, il peut être maintenu dans ces conditions pour une durée maximale d'un mois. </li> 2. Détermination de la planctoniques minimum cellule de concentration inhibitrice sessile métabolique (PSMIC) Pour déterminer la concentration minimale inhibitrice métabolique (PSMIC) des valeurs de 15 plancton cultivé P. isolats aeruginosa, la méthode de microdilution doit être effectuée, comme décrit dans les lignes directrices de la British Society for chimiothérapie antimicrobienne BSAC 12. L'antibiotique de choix, dans ce sulfate de tobramycine cas, est dilué en série dans du milieu Luria-Bertani (LB) dans une plaque de microtitration à 96 puits pour fournir une gamme appropriée de concentrations d'antibiotiques. Diluer cultures d'une nuit de P. aeruginosa dans LB jusqu'à une DO 600 de 0,05 (± 0,01) et ajouter 100 volumes ul dans les puits de la microplaque de 96 puits contenant 100 pi de l'antibiotique dilué en série. Dans ce cas, les concentrations finales de la tobramycine sulfate variait entre 512 à 0,5 pg / ml. Huit répétitions de chaque ANTIBconcentration iotic doit être effectuée. Puits témoin négatif pour chaque isolat doit être mis en place, dans lequel aucun antibiotique est ajouté. En outre, huit puits doit contenir LB uniquement pour une utilisation en tant que vierge lors de l'analyse en aval (section 2.6). Incuber les plaques à 96 puits de microtitration pour 1 – 2 jours à 37 ° C sans agitation dans des conditions aérobies ou microaérophiles (5% O 2, 10% de CO 2, et 85% N 2). Microaérophilie sont obtenus grâce aux modules de génération de gaz CampyGen dans de grandes jarres anaérobies. Après l'incubation, la croissance bactérienne est déterminée en mesurant l'absorbance de la culture bactérienne dans chaque puits à une longueur d'onde de 600 nm en utilisant un lecteur de microplaques Fluostar Omega et le logiciel d'analyse des données MARS. L'absorption à partir des cultures planctoniques antibiotiques traités (A cellules planctoniques antibiotiques traités) et l'absorption des contrôles négatifs (un contrôle négatif) doit être corrigée par soustractionion de l'absorbance de fond obtenu à partir de la LB puits ne contenant que (Un blanc). Le pourcentage d'inhibition de la viabilité est ensuite calculé comme (moyenne ± cellules planctoniques antibiotiques traités / moyenne Un contrôle négatif) x 100%. Le PSMIC 90 est défini comme la concentration en antibiotique provoquant une inhibition de la croissance 90% planctoniques bactérienne. Pour déterminer la viabilité bactérienne après traitement avec l'antibiotique de choix, 10 pl de 0,02% (v / v) résazurine (dilué dans de l'eau distillée) est ajouté à chaque puits et les plaques sont incubées dans des conditions aérobies pendant 1 – 2 h à 37 ° C, tout en agitant à 150 rpm. Les cellules viables permettra de réduire le colorant bleu résazurine à la forme résorufine rose fluo. Après incubation avec la résazurine, à surveiller la fluorescence de chaque puits en utilisant une longueur d'onde d'excitation de 540 nm et une longueur d'onde d'émission de 590 nm dans un lecteur de microplaque Fluostar oméga. Les données doivent être analysées comme décrit êtrebas. 3. Détermination du biofilm portable concentration inhibitrice minimale sessile (BSMIC) Cultures pendant la nuit de P. aeruginosa (dans ce cas, 15 isolats de P. aeruginosa sont utilisés) doivent être dilués dans du LB jusqu'à une DO 600 de 0,05 (± 0,01), 1:100, puis diluée à l'ASM frais (volume total 1,8 ml). Les cultures dilué (1,8 ml) doit être ajouté à chaque puits d'une plaque de 24 puits de culture de tissus traités. Trois puits doit contenir ASM uniquement pour une utilisation en tant que vierge lors de l'analyse en aval (section 3.9). Fixer les plaques à 24 puits avec de laboratoire parafilm et incuber pendant 3 jours dans des conditions aérobies ou microaérophiles à 37 ° C, tout en agitant à 75 rpm. Microaérophilie devrait être obtenue en utilisant CampyGen paquets de génération de gaz dans de grandes jarres anaérobies. Diluer l'antibiotique de choix, dans ce sulfate de tobramycine cas, de fournir une gamme de concentration appropriée en eau douceASM. Dans ce cas, les concentrations finales se situait entre 512 à 1 ug / ml. Ajouter à chaque concentration de l'antibiotique, dans des volumes de 200 pi, dans les puits appropriés des plaques à 24 puits. Quatre répétitions de chaque concentration d'antibiotique doit être effectuée. Les biofilms ne sont pas exposés à l'antibiotique de choix ont été utilisées comme contrôle négatif. Fixer les plaques à 24 puits avec de laboratoire parafilm et incuber dans des conditions aérobies ou microaérophiles pour encore 24 h à 37 ° C, tout en agitant à 75 rpm. Après une incubation en présence de l'antibiotique de choix, de perturber les biofilms bactériens en utilisant 100 pi de 100 mg / ml de cellulase (dilué dans tampon 0,05 M de citrate [9,6 g / l Citrate.H 2 0 dans l'eau et le pH à 4,6 avec NaOH] ) et incuber les plaques à 24 puits dans des conditions aérobies à 37 ° C, tout en agitant à 150 rpm pendant 1 h. Si nécessaire, les biofilms pourrait être perturbé par pipetage manuel à ce stade. Pour déterminer les activités métaboliquesdes cellules bactériennes libérées par les biofilms perturbé, 100 pi de 0,02% (v / v) résazurine (dilué dans de l'eau distillée) devraient être ajoutés à chaque puits des plaques à 24 puits et incubées pendant 1 à 2 h à 37 ° C , tout en agitant à 150 rpm. Après incubation avec la résazurine, mesurer la fluorescence de chaque puits en utilisant une longueur d'onde d'excitation de 540 nm et une longueur d'onde d'émission de 590 nm dans un lecteur de microplaque Fluostar oméga et le logiciel d'analyse des données MARS. Fluorescence provenant des biofilms antibiotique F-imprégnées (antibiotique traités biofilms) et de la fluorescence à partir des contrôles négatifs (F commande négative) doit être corrigé par soustraction de la fluorescence de fond obtenu à partir des puits contenant l'ASM que (F flan). Le pourcentage d'inhibition de la viabilité est ensuite calculé comme (moyenne de F antibiotiques biofilms traités / F signifie un contrôle négatif) x 100%. Le BSMIC 90 est défini comme le antibioconcentration entraînant une inhibition tic 90% de l'activité métabolique. 4. Les résultats représentatifs La formation de biofilm ASM est possible dans les petites (2 ml) volumes et les biofilms sont entièrement formées dans les 3 jours (figure 1A). Ceci peut être démontré en se conformant rigoureusement pipetage du biofilm, ce qui devrait être difficile à perturber. Les microcolonies sont comparables à celles qui sont cultivées dans de plus grands volumes 4 (figure 1B). La figure 2 montre des différences importantes entre les cellules cultivées plancton et dans un biofilm, tel que détecté par analyse d'image au microscope électronique. Cultures biofilms montrent clairement des niveaux considérables de la matrice extracellulaire qui entoure les cellules et les structures individuelles au sein du biofilm sont difficiles à identifier. Plusieurs études suggèrent que le mode de vie biofilm peut affecter la sensibilité aux antimicrobiens 13, 14. Notre petite échelle dosage ASM peut être utilisé pour détérmine l'BSMIC de plusieurs antibiotiques des isolats multiples en même temps. Le flux de travail de l'essai est illustré à la figure 3. L'effet des antibiotiques sur la viabilité de la cellule bactérienne peut être mesurée à l'aide du test à la résazurine. Les antibiotiques, dans ce cas la tobramycine, peut être ajouté à la biofilm établi et mis à incuber pendant 24 h. Après ce biofilm est perturbé et la résazurine est ajouté. Cellules métaboliquement actives peuvent réduire le colorant résazurine résultant en un changement de couleur du bleu (résazurine) au rose (résorufine) 15. La figure 4A montre un dosage exemple dans lequel P. aeruginosa a été incubées avec différentes concentrations de tobramycine avant la perturbation biofilm et l'ajout de résazurine dans une plaque de microtitration. Le bleu non fluorescent de couleur indique les cellules non viables, tandis que les cellules viables de réduire le colorant à la forme rose fluo, résorufine. Le SMIC peut alors être calculée en convertissant la fluorescence en pourcentagerestant la viabilité bactérienne. La figure 4B montre le changement de la viabilité% avec une concentration croissante de tobramycine. La viabilité de 10% a été choisi comme une coupure dans le but de calculer les années 90 SMIC. Dans des conditions aérobies, les tobramycine SMIC 90 valeurs sont plus élevées pour les cellules cultivées sous forme de biofilm que ceux des cultures planctoniques. Le tableau 1 montre la variation de PSMIC 90 et 90 pour BSMIC tous les isolats testés. Le tableau 2 montre que dans des conditions aérobies, une augmentation spectaculaire de la résistance à la tobramycine (2 à> 32 fois plus de SMIC) a été observée pour la plupart des isolats lorsqu'ils sont cultivés en ASM (biofilm mode) par rapport à LB (mode planctoniques). En outre, les biofilms cultivées dans des conditions exposées microaérophilie une SMIC augmenté comprise entre 2 et> 128 fois par rapport à biofilm cultivées dans des conditions aérobies. Figure1. La formation du biofilm de P. aeruginosa dans ASM P. PAO1 aeruginosa souche forme des touffes visibles macroscopiquement (microcolonies) lorsqu'elles sont cultivées à l'ASM. Une formation de biofilms, dans 30 ml cultures ASM (grande échelle) après une croissance de 7 jours à bouchon à vis en verre Duran flacons. B, la formation de biofilms dans les cultures de 2 ml ASM ( à petite échelle) après une croissance de 3 jours dans des plaques de polystyrène de 24 puits. Figure 2. Micrographies TEM des biofilms ASM A / C TEM micrographie (x; 27.000) de PAO1 grandi plancton et à l'ASM, respectivement, B / D TEM micrographie (x57, 000) de la planctoniques PAO1grown et à l'ASM, respectivement. Bactéries ont été cultivées plancton cultivées durant la nuit dans du bouillon LB. Les biofilms ont été cultivés pendant 7 jours dans les cultures ml 30 ASM. Les flèches noires référence à des cellules dans le biofilm et les étoiles se référer à des espaces extracellulaires. Barres d'échelle = 1um. Figure 3. Flux de travail de l'essai ASM biofilm sensibilité aux antimicrobiens. Figure 4. Utilisation de la résazurine pour la détermination de la sensibilité aux antibiotiques Les cellules bactériennes ont été incubées avec différentes concentrations de l'antibiotique et l'activité métabolique restant a été déterminée en utilisant la résazurine. A, Le bleu non fluorescent forme oxydée de la résazurine indique les cellules non viables et est réduite par métabolique cellules actives au rose fluorescent résorufine. B, l'intensité de fluorescence est converti en pourcentage de la viabilité bactérienne restante. La viabilité de 10% a été choisi comme seuil afin de calculer l'MSMIC90. Cliquez ici pour voir LARger la figure. </span> Les souches PSMIC 90 (pg / ml) 1 BSMIC 90 (pg / ml) 1 Aérobique 2 microaérophile Aérobique 2 microaérophile PAO1 4 4 8 > 512 Liverpool souche épidémique (ERP) isole LESB58 21 8 64 64 128 LES400 22 32 128 8 256 LESB25 16 32 256 512 LESB55 16 64 64 > 512 LESB64 16 64 > 512 > 512 LES431 22 4 8 32 > 512 LESB49 16 64 64 256 LES109 32 128 32 > 512 Non-ERP isolats 49461 16 32 16 > 512 59032 0.5 2 4 > 512 59073 > 512 > 512 > 512 > 512 59076 16 32 32 > 512 </Td> 27 8 16 4 > 512 45 16 32 4 > 512 Tableau 1. La sensibilité de P. aeruginosa à la tobramycine. 1 Pour la détermination de PSMICs et BSMICs tobramycine a été utilisé dans 2-dilutions allant de 512 à 0,5 pg / ml (n = 8 pour chaque concentration) et de 512 à 1 ug / ml (n = 4 pour chaque la concentration), respectivement;; PSMICs sont déterminées en utilisant la norme 1 Méthode microdilution. 2 microaérophilie étaient de 5% 2 O, 10% de CO 2, et 85% de N 2. Souche PSMIC 90 / BSMIC une variation de 90 fois 1 PSMIC aérobie → PSMIC microaérophile BSMIC aérobie → BSMIC microaérophile PSMIC aérobie → BSMIC aérobie PSMIC microaérophile → BSMIC microaérophile PAO1 0 > 64 2 128 LES isole LESB58 8 2 8 2 LES400 4 32 0,25 2 LESB25 2 2 16 16 LESB55 4 > 8 </td> 4 > 8 LESB64 4 ND > 32 > 8 LES431 2 > 16 8 > 64 LESB49 4 4 4 4 LES109 4 16 0 > 4 Non-ERP isolats 49461 2 > 32 0 > 16 59032 4 > 128 8 > 256 59073 ND ND ND ND 59076 2 > 16 </td> 2 > 16 27 2 > 128 0.5 > 32 45 2 > 128 0,25 > 16 Tableau 2. Changement Fold PSMICs et BSMICs à la tobramycine. 1 ND = non déterminé, les valeurs en caractères gras indiquent les changements SMIC pli> 10.