Uso de un medio artificial de esputo para probar la eficacia de antibióticos contra la<em> Pseudomonas aeruginosa</em> En condiciones más pertinentes a la fibrosis quística pulmonar

1. Preparación del medio de esputo Artificial (ASM) Añadir 4 g de ADN de esperma de pescado a 250 ml de agua estéril muy lentamente durante un período de varias horas. El ADN lleva varias horas para disolver completamente y se puede agitó durante la noche a temperatura ambiente. Añadir 5 g de mucina de estómago porcino (tipo II) lentamente a 250 ml de agua estéril hasta que la mucina se haya disuelto completamente. La solución puede ser agitada durante la noche a 4 ° C. Disolver 0,25 g de cada esenciales y no esenciales-L-aminoácido, con la excepción de la L-tirosina y L-cisteína, en 100 ml de agua estéril. Disolver 0,25 g de L-cisteína en 25 ml de hidróxido de potasio 0,5 M (M r 56,11 g / mol) y 0,25 g de L-tirosina en 25 ml de agua estéril. Disolver 5,9 mg de ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), 5 g de NaCl y 2,2 g de KCl en 100 ml de agua estéril. Combinar el ADN, la mucina, L-aminoácidos, DTPA, NaCl y KCl en una botella de 1 litro. Añadir 5 ml de yema de huevo emulsion y relleno de aproximadamente 850 ml con agua estéril. Ajustar el pH a 6,9 con Tris 1 M (pH 8,5; Mr 121.14) y llevar el volumen a 1 litro con agua estéril. Esterilizar la ASM por filtración utilizando un ME Vacuubrand 2 bomba de vacío Millipore diafragma y unidades Steritop filtro con un tamaño de poro y el cuello de 0,22 micras y 45 mm, respectivamente. Cada unidad Steritop filtro puede ser re-utilizada inmediatamente hasta tres veces, sin embargo, los filtros deben ser lavadas dos veces con agua estéril antes de su reutilización. El proceso de filtración es lenta y se puede realizar durante 2 días. Otras versiones de ASM se han desarrollado para usar la adición de antibióticos en lugar de la filtración de 11 Sin embargo, debido a posibles interacciones medicamentosas, no se recomienda el método de esta aplicación en particular. Sin filtrar y se filtró ASM debe almacenarse a 4 ° C en la oscuridad. Usando fresco ASM se recomienda sin embargo, se puede mantener bajo estas condiciones durante un máximo de un mes. </li> 2. Determinación de la concentración mínima planctónicas sésiles célula inhibitoria metabólico (PSMIC) Para determinar la concentración mínima inhibitoria metabólico (PSMIC) Los valores para el 15 de planktonically crecido P. aeruginosa, el método de microdilución se debe realizar, como se describe en las directrices de la Sociedad Británica de Quimioterapia Antimicrobiana BSAC 12. El antibiótico de elección, en este caso sulfato de tobramicina, se diluyen en serie en medio Luria-Bertani (LB) en una placa de microtitulación de 96 pocillos para proporcionar una gama apropiada de concentraciones de antibiótico. Diluir cultivos de una noche de P. aeruginosa en LB a una OD 600 de 0,05 (± 0,01) y añadir 100 volúmenes l a los pocillos de la placa de microtitulación de 96 pocillos que contenía 100 l del antibiótico diluyen en serie. En este caso, las concentraciones finales de tobramicina sulfato osciló entre 512 a 0,5 g / ml. Ocho repeticiones de cada ANTIBconcentración iotic debe ser realizada. Pozos de control negativo para cada aislamiento se debe establecer, en el que ningún antibiótico, se añade. Además, ocho pozos debe contener LB sólo para su uso como un blanco durante el análisis de aguas abajo (Sección 2,6). Incubar las placas de 96 pocillos de microtitulación durante 1 – 2 días a 37 ° C sin agitación en condiciones aeróbicas o microaerófilos (5% O 2, 10% de CO 2, y 85% N 2). Condiciones microaerófilas se obtienen utilizando CampyGen paquetes de generación de gas en grandes jarras anaeróbicas. Después de la incubación, el crecimiento bacteriano se determina midiendo la absorbancia del cultivo bacteriano en cada pocillo a una longitud de onda de 600 nm utilizando un lector de microplacas Fluostar Omega y el software de análisis de datos MARS. La absorción de los cultivos planctónicos tratados con antibióticos (un antibiótico tratadas las células planctónicas) y la absorción de los controles negativos (un control negativo) deben ser corregidos por restarión de la absorbancia de fondo obtenido a partir de la LB pocillos que contienen sólo (un blanco). El porcentaje de inhibición de la viabilidad posteriormente se calcula como (media ± antibióticos células tratadas planctónicos / media Un control negativo) x 100%. El PSMIC 90 se define como la concentración de antibiótico que causa 90% de inhibición del crecimiento bacteriano planctónicos. Para determinar la viabilidad bacteriana después del tratamiento con el antibiótico de elección, 10 l de 0,02% (v / v) resazurina (diluido en agua destilada) se añade a cada pocillo y las placas se incuban en condiciones aerobias durante 1 – 2 horas a 37 ° C, mientras se agitaba a 150 rpm. Las células viables se reducirá el colorante azul de resazurina a la forma resorufina rosa fluorescente. Después de la incubación con resazurina, controlar la fluorescencia de cada pocillo utilizando una longitud de onda de excitación de 540 nm y una longitud de onda de emisión de 590 nm en un lector de microplacas Fluostar Omega. Los datos deben ser analizados como se describe a serbajo. 3. Determinación de la concentración celular de biopelículas albar mínima inhibitoria (BSMIC) Cultivos de una noche de P. aeruginosa (en este caso, 15 cepas de P. aeruginosa se ​​utilizan) debe ser diluido en LB a una OD 600 de 0,05 (± 0,01), 1:100 continuación volver a diluir en agua dulce ASM (volumen total 1,8 ml). Los cultivos diluidas (1,8 ml) debe ser añadido a cada pocillo de una placa de tejido de 24 pocillos cultivo tratado. Tres pocillos debe contener ASM sólo para su uso como un blanco durante el análisis de aguas abajo (Sección 3,9). Fijar las placas de 24 pocillos con laboratorio Parafilm y se incuba durante 3 días en condiciones aeróbicas o microaerofílico a 37 ° C, mientras se agita a 75 rpm. Condiciones microaerófilas deben obtenerse utilizando CampyGen paquetes de generación de gas en grandes jarras anaeróbicas. Diluir el antibiótico de elección, en este caso sulfato de tobramicina, para proporcionar un intervalo de concentración apropiada en frescoASM. En este ejemplo, las concentraciones finales oscilaron entre 512 a 1 mg / ml. Añadir cada concentración del antibiótico, en volúmenes de 200 l, a los pocillos apropiados de las placas de 24 pocillos. Cuatro réplicas de cada concentración de antibiótico se debe realizar. Las biopelículas no expuestas al antibiótico de elección se utilizaron como control negativo. Fijar las placas de 24 pocillos con laboratorio Parafilm y se incuba en condiciones aerobias o microaerofílico durante 24 horas a 37 ° C, mientras se agita a 75 rpm. Después de la incubación en presencia del antibiótico de elección, interrumpir las biopelículas bacterianas utilizando 100 l de 100 mg / ml de celulasa (diluido en tampón citrato 0,05 M [9,6 g / l Citrate.H 2 0 en el agua y el pH a 4,6 con NaOH] ) e incubar las placas de 24 pocillos en condiciones aerobias a 37 ° C, mientras se agitaba a 150 rpm durante 1 h. Si es necesario, las biopelículas podría ser más interrumpido por pipeteado manual en esta etapa. Para determinar las actividades metabólicasde las células bacterianas liberados de las biopelículas interrumpidas, 100 l de 0,02% (v / v) resazurina (diluido en agua destilada) se añadió a cada pocillo de las placas de 24 pocillos y se incubaron durante 1 a 2 horas a 37 ° C , mientras se agitaba a 150 rpm. Después de la incubación con resazurina, medir la fluorescencia de cada pocillo utilizando una longitud de onda de excitación de 540 nm y una longitud de onda de emisión de 590 nm en un lector de microplacas Fluostar Omega y el software de análisis de datos MARS. Fluorescencia de las biopelículas tratados con antibióticos (F tratados con antibióticos biopelículas) y la fluorescencia de los controles negativos (control negativo F) debe ser corregida por sustracción de la fluorescencia de fondo obtenido a partir de los pocillos que contienen sólo ASM (F en blanco). El porcentaje de inhibición de la viabilidad posteriormente se calcula como (media de F biopelículas antibióticos tratados / F: control negativo) x 100%. El BSMIC 90 se define como la antibioticoterapiaconcentración tic causando 90% de inhibición de la actividad metabólica. 4. Los resultados representativos La formación de biopelículas ASM es posible en pequeñas (2 ml) y los volúmenes de las biopelículas están completamente formadas dentro de 3 días (Figura 1A). Esto se puede demostrar por pipeteado rigurosamente la biopelícula, que debe ser difícil de alterar. Las microcolonias son comparables a los que se cultivan en grandes volúmenes 4 (Figura 1B). Figura 2 muestra las principales diferencias entre las células cultivadas planktonically y en una biopelícula como se detectó por análisis de imagen microscópica de electrones. Biofilm culturas muestran claramente niveles considerables de la matriz extracelular que rodea las células y estructuras individuales dentro del biofilm son difíciles de identificar. Varios estudios sugieren que el estilo de vida de biopelículas pueden afectar la susceptibilidad antimicrobiana 13, 14. Nuestro pequeño ensayo de ASM a escala se puede utilizar para determine la BSMIC de múltiples antibióticos para aislamientos múltiples al mismo tiempo. El flujo de trabajo del ensayo se muestra en la Figura 3. El efecto de los antibióticos sobre la viabilidad celular bacteriana se puede medir utilizando el ensayo de resazurina. Los antibióticos, en este caso tobramicina, se puede añadir a la biopelícula establecido y se incubaron durante 24 h. Después de esta biopelícula se interrumpe y la resazurina se añade. Células metabólicamente activas pueden reducir el colorante resazurina resultando en un cambio de color de azul (resazurina) a rosa (resorufina) 15. Figura 4A muestra un ensayo de ejemplo en el que p aeruginosa se ​​incubó con diferentes concentraciones de tobramicina antes de la interrupción del biofilm y la adición de resazurina en una placa de microtitulación. El azul no fluorescente de color indica células no viables, mientras que las células viables reducir el colorante a la forma rosa fluorescente, resorufina. El SMIC entonces puede calcularse mediante la conversión de fluorescencia en porcentajerestante viabilidad bacteriana. Figura 4B muestra el cambio en la viabilidad% con la concentración creciente de tobramicina. 10% de viabilidad fue elegido como un punto de corte a fin de calcular el SMIC 90. En condiciones aeróbicas, los tobramicina SMIC 90 valores son más altos para las células cultivadas como un biofilm que las de los cultivos planctónicos. La Tabla 1 muestra la variación en PSMIC 90 y 90 BSMIC para todos los aislados ensayados. Tabla 2 muestra que bajo condiciones aeróbicas, un aumento espectacular en la resistencia a la tobramicina (2 a> 32 veces mayor en SMIC) se observó para la mayoría de los aislados cuando se cultiva en ASM (biopelícula modo) en comparación con LB (modo planctónicos). Además, las biopelículas que crecen bajo condiciones microaerófilas exhibió un aumento de SMIC entre 2 y> 128 plegable cuando se compara con las biopelículas que crecen bajo condiciones aeróbicas. Figura1. La formación de biopelículas de P. aeruginosa en ASM P. Aeruginosa cepa PAO1 forma grumos visibles macroscópicamente (microcolonias) cuando se cultivan en ASM. A, la formación de biopelículas en 30 ml culturas ASM (gran escala), después de 7 días de crecimiento en el tornillo de la tapa de vidrio Duran frascos. B, La formación de biopelículas en los cultivos de 2 ml ASM ( pequeña escala) después de 3 días de crecimiento en placas de poliestireno de 24 pocillos. Figura 2. Las micrografías TEM de biopelículas ASM A / C TEM micrografía (x; 27.000) de la PAO1 crecido planktonically y en ASM, respectivamente, B / D TEM micrografía (x57, 000) de plancton PAO1grown y en ASM, respectivamente. Las bacterias que crecen planktonically se cultivó durante la noche en caldo LB. Las biopelículas se cultivaron durante 7 días en 30 ml de cultivos de ASM. Las flechas negras se refieren a las células dentro de la biopelícula y las estrellas se refieren a los espacios extracelulares. Las barras de escala = 1micras. Figura 3. Flujo de trabajo de la prueba de susceptibilidad antimicrobiana ASM biofilm. Figura 4. El uso de resazurina para la determinación de la susceptibilidad a antibióticos células bacterianas fueron incubadas con diferentes concentraciones del antibiótico y la actividad metabólica restante se determinó utilizando resazurina. A, el azul no fluorescente forma oxidada de resazurina indica células no viables y se reduce por metabólico células activas a rosa fluorescente resorufina. B, la intensidad de fluorescencia se convierte en porcentaje de viabilidad bacteriana restante. 10% de viabilidad fue elegido como punto de corte con el fin de calcular el MSMIC90. Haga clic aquí para ver la LARger figura. </span> Las cepas PSMIC 90 (g / ml) 1 BSMIC 90 (g / ml) 1 Aerobio Microaerofílico 2 Aerobio Microaerofílico 2 PAO1 4 4 8 > 512 Liverpool cepa epidémica (LES) de los aislamientos LESB58 21 8 64 64 128 LES400 22 32 128 8 256 LESB25 16 32 256 512 LESB55 16 64 64 > 512 LESB64 16 64 > 512 > 512 LES431 22 4 8 32 > 512 LESB49 16 64 64 256 LES109 32 128 32 > 512 No LES aislados 49461 16 32 16 > 512 59032 0.5 2 4 > 512 59073 > 512 > 512 > 512 > 512 59076 16 32 32 > 512 </Td> 27 8 16 4 > 512 45 16 32 4 > 512 Tabla 1. La susceptibilidad de P. aeruginosa a la tobramicina. 1 Para la determinación de PSMICs y tobramicina BSMICs fue utilizado en dos diluciones dobles que van desde 512 hasta 0,5 g / ml (n = 8 para cada concentración) y 512 a 1 mg / ml (n = 4 para cada concentración), respectivamente;; PSMICs se determinaron utilizando el estándar microdilución método 1. 2 condiciones de microaerofilia fueron del 5% de O 2, 10% de CO 2, y el 85% de N 2. Tensión PSMIC 90 / BSMIC 90 veces el cambio 1 PSMIC aeróbico → PSMIC microaerófilos BSMIC aeróbico → BSMIC microaerófilos PSMIC aeróbico → BSMIC aeróbica PSMIC microaerófilos → BSMIC microaerófilos PAO1 0 > 64 2 128 LES aísla LESB58 8 2 8 2 LES400 4 32 0,25 2 LESB25 2 2 16 16 LESB55 4 > 8 </td> 4 > 8 LESB64 4 ND > 32 > 8 LES431 2 > 16 8 > 64 LESB49 4 4 4 4 LES109 4 16 0 > 4 No LES aislados 49461 2 > 32 0 > 16 59032 4 > 128 8 > 256 59073 ND ND ND ND 59076 2 > 16 </td> 2 > 16 27 2 > 128 0.5 > 32 45 2 > 128 0,25 > 16 Tabla 2. Veces el cambio de PSMICs y BSMICs a la tobramicina. 1 ND, no determinado, los valores en negrita indican SMIC cambios veces más de 10.