استخدام متوسط البلغم الاصطناعي لاختبار فعالية المضادات الحيوية لمكافحة<em> الزائفة الزنجارية</em> في شروط أكثر ملاءمة لالرئة التليف الكيسي
Summary
التشخيص الحالية اختبار الحساسية للمضادات الميكروبات يعتمد على نمو العوالق من العزلات في المغذيات الظروف، غنية الهوائية. هنا، ونحن توظيف بديل المتوسطة البلغم الاصطناعية لدراسة قابلية مضادات الميكروبات من الأغشية الحيوية الزائفة الزنجارية تحت كل الظروف الهوائية وmicroaerophilic أكثر تمثيلا في الرئة التليف الكيسي.
Abstract
هناك قلق متزايد حول أهمية في الفحوص المختبرية قابلية مضادات الميكروبات عند تطبيقها على عزلات من P. الزنجارية من المرضى الكيسي (CF) التليف. الأساليب الحالية تعتمد على واحد أو عدد قليل العزلات نمت هوائيا وplanktonically. وتستخدم سلفا انقطاع لتحديد ما إذا كانت بكتيريا حساسة أو مقاومة للمضادات الحيوية أي يعطى 1. ومع ذلك، أثناء التهابات الرئة المزمنة في قوات التحالف، P. السكان الزنجارية موجودة في الأغشية الحيوية، وهناك أدلة على أن البيئة هي microaerophilic إلى حد كبير 2. ودعت الفرق صارخ في ظروف بين بكتيريا في الرئة، وهؤلاء خلال الاختبارات التشخيصية في مسألة مدى ملاءمة والموثوقية وحتى هذه الاختبارات 3.
اصطناعية المتوسطة البلغم (ASM) هو وسيلة الثقافة التي تحتوي على مكونات من البلغم مريض التليف الكيسي، بما في ذلك الأحماض الأمينية، والميوسين والحمض النووي الحرة. ب. الزنجارية </ م> نمو في نمو يقلد ASM خلال العدوى CF، مع تشكيل هياكل بيوفيلم الذاتي في مجموعها، واختلاف عدد السكان 4،5،6. وكان الهدف من هذه الدراسة لتطوير فحص microtitre لوحة لدراسة قابلية مضادات الميكروبات من P. الزنجارية على أساس النمو في ASM، والتي تنطبق على كل الشروط microaerophilic والهوائية.
وقد وضعت لفحص ASM في شكل لوحة microtitre. P. وسمح الزنجارية الأغشية الحيوية لتطوير لمدة 3 أيام قبل الحضانة مع العوامل المضادة للجراثيم في تركيزات مختلفة لمدة 24 ساعة. بعد انقطاع بيوفيلم، وقد تم قياس بقاء الخلية بواسطة تلطيخ مع ريسازورين. وقد استخدم هذا الاختبار للتأكد من الحد الأدنى خلية تركيز المثبطة لاطئة (SMIC) من توبراميسين لمدة 15 P. مختلفة وتمت مقارنة عزلات الزنجارية في ظل ظروف جوية وmicroaerophilic والقيم SMIC لتلك التي حصلت مع مرق نمو قياسية. في حين كان هناكوبعض الأدلة على القيم هيئة التصنيع العسكري المتزايد للعزلة التي تزرع في ASM بالمقارنة مع نظرائهم من العوالق، وجدت اكبر الخلافات مع بكتيريا اختبارها في ظروف microaerophilic، الذي أظهر مقاومة كبيرة ليصل إلى أضعاف 128>، نحو توبراميسين في النظام عندما ASM بالمقارنة مع فحوصات أجريت في ظروف هوائية.
وشكك في عدم وجود ارتباط بين الأساليب الحالية اختبارات الحساسية والنتائج السريرية من صحة الأساليب الحالية 3. وقد استخدمت عدة نماذج في المختبر من قبل لدراسة P. الأغشية الحيوية الزنجارية 7 و 8. ومع ذلك، هذه الأساليب تعتمد على الأغشية الحيوية سطح المرفقة، في حين أن الأغشية الحيوية ASM تشبه تلك التي لوحظت في الرئة CF 9. وبالإضافة إلى ذلك، وقد تبين انخفاض تركيز الأكسجين في مخاط لتغيير سلوك P. الزنجارية (2) وتؤثر على قابلية المضادات الحيوية 10. النقيب ولقد ز ASM في ظل ظروف microaerophilic توفير بيئة أكثر واقعية للدراسة حساسية الجراثيم للأدوية.
Protocol
Discussion
في هذه الدراسة استخدمنا رواية في المختبر على أساس نموذج ASM لتكرار P. شروط بيوفيلم الزنجارية في 4 الرئة CF. تم تعديل نموذج ناجح لصغار التجارب الإنتاجية العالية، من العوامل المضادة للجراثيم.
الخطوات الحاسمة لهذا الفحص هي:
- يتفق إعداد وسائل الإعلام ASM والعقم الحفاظ. لقد كرسنا ساعات طويلة لتحقيق الاستفادة المثلى من الطريقة التي يتم إضافة كل مكون من أجل تحقيق نتائج استنساخه في كل مرة. في ترشيح ASM بطيء ولكن من الأفضل جهاز الأوتوكليف، والتي قد تؤدي إلى تلف عنصر الميوسين. نحن لا ننصح بإضافة المضادات الحيوية، وعلى النحو الذي اقترحه 11 آخرين لأن ذلك قد فرض ضغوطا كبيرة انتقائي، والطفرات محرك، حث تحلل طليعة العاثية 16 و تغيير كبير في التعبير عن الجينات البكتيرية متعددة.
- وينبغي أن يكون الأمثل للفحص وفقا لحجم سو تستخدم ASM. وزادت سرعة اهتزاز لأصغر وحدات التخزين ولكن لوحظ أنه أقصر بيوفيلم دورة الحياة.
تطبيق واضح لنموذج صغير الحجم بيوفيلم ASM هو تحديد أكثر واقعية من حساسيات بيوفيلم المضادة للجراثيم (BSMIC 90). محاريب اللاهوائية وmicroaerophilic موجودة في الرئة CF وهناك أدلة على أن يقتصر الأوكسجين في أعماق الأغشية الحيوية ناضجة 2 و 17. هنا علينا أن نبرهن على 10/14 P. السريرية العزلات الزنجارية من CF المريض sputa يحمل كبير (4 – ≥ 128 أضعاف) انخفاض في الحساسية للتوبراميسين في ظل ظروف microaerophilic في ASM. نتائج هذه الدراسة تشير إلى أن المضادات الحيوية، مثل توبراميسين، قد يكون أقل فعالية ضد P. التهابات في الرئة الزنجارية CF مما تشير إليه الأساليب التقليدية اختبار الحساسية. وتعكس هذه النتائج دراسات سابقة على حساسية الجراثيم للأدوية من الأغشية الحيوية 10. الصغيرةالمقايسات ASM نطاق بالتالي لا تقدم بسيط منصة إنتاجية عالية لتوليد بيانات ذات مغزى حساسية للمضادات الحيوية لإبلاغ قرارات أفضل العلاجية. ويقتصر الفحص بنفس الطريقة التقليدية مثل اختبارات الحساسية للمضادات الحيوية في تلك المستعمرات واحدة يتم انتقاؤها للفحص والتي قد لا تكون ممثلة لجميع السكان. ومع ذلك، فإننا نعتقد أن هذا النهج (ط) باستخدام غير سطح نمو بيوفيلم المرفقة و (ب) تنطبق على ظروف microaerophilic، يمثل بديلا واضحا، وتحسين القدرة على الطرق الحالية. نخلص إلى أن هذا الاختبار هو نموذج مناسب لدراسة P. السكان الزنجارية بيوفيلم. وإجراء مزيد من التجارب السريرية في التأكد مما إذا كانت حساسيات المضادات الحيوية على أساس بيوفيلم، نمت P. ويمكن أن يؤدي إلى الزنجارية الخيارات للمضادات الحيوية المختلفة مع تحسن النتائج المحتملة الميكروبيولوجية والسريرية. وأظهرت تحقيقات مماثلة باستخدام نماذج بيوفيلم القيم الكلاسيكية التي تؤدي BSMICإلى توصيات مختلفة لتلقي العلاج بالمضادات الحيوية 5،17.
بالإضافة إلى اختبار لمدى فعالية المضادة للعدوى وكلاء، ونظام ASM يمثل رخيصة، والبديل بسيطة وقابلة للتكرار لنماذج حيوانية للدراسات مثل تلك التي تهدف إلى فهم تنوع P. الزنجارية السكان. لاحظنا عدم التجانس واسعة في مجال السكان الطبيعي من P. الزنجارية تعافى من CF المريض sputa 18 و 19. ويمكن ملاحظة مماثلة تنويع المظهري والوراثي في النمو خلال ASM 4 (والبيانات المتوفرة لدينا غير منشورة)، مما يجعلها جذابة في نموذج المختبر من الشروط الرئة CF. البساطة النسبية للنموذج ASM يجعل من السهل تصميم تجارب التكيف على المدى الطويل تهدف، على سبيل المثال، في رصد آثار من المضادات الحيوية أو غيرها من الضغوط على بي. الزنجارية اختلاف عدد السكان. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تزرع مسببات الأمراض البكتيرية الأخرى فيASM. على سبيل المثال، Fouhy وآخرون استخدموا 2007 ASM لدراسة تشكيل بيوفيلم من قبل س. maltophillia 20.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نعترف بدعم من المعهد الوطني للمملكة المتحدة لبحوث الصحة، والدكتور Hadwen الثقة للبحوث الإنسانية، الرائدة في المملكة المتحدة خيرية للابحاث الطبية تمويل التقنيات حصرا البحوث غير الحيوانية لتحل محل التجارب على الحيوانات، ويلكوم ترست (جرانت 089215). نعترف أيضا شركة نوفارتيس للادوية المحدودة في المملكة المتحدة (منحة تربوية غير المقيد).
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
| DNA from fish sperm | Sigma-Aldrich | 74782 |
| Mucin from porcine stomach, type II | Sigma-Aldrich | M2378 |
| L-Alanine | Acros Organics | 102830250 |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006 |
| L(+)-Asparagine monohydrate | Acros Organics | 175271000 |
| L(+)-Aspartic acid | Acros Organics | 105041000 |
| L-Cysteine | Sigma-Adrich | 168149 |
| L(+)-Glutamic acid | Acros Organics | 156211000 |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 |
| Glycine | Acros Organics | 220911000 |
| L-Histidine | Sigma-Adrich | H8000 |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 |
| L(+)-Lysine monohydrochloride | Acros Organics | 125222500 |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M9625 |
| L-Phenylalanine | Acros Organics | 130310250 |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 |
| L-Serine | Acros Organics | 132660250 |
| L-Threonine | Acros Organics | 138930250 |
| L(-)-Tryptophan | Acros Organics | 140590250 |
| L-Tyrosine | Acros Organics | 140641000 |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500 |
| Diethylenetriaminepentaacetic acid | Sigma-Aldrich | 32318 |
| NaCl | Fisher Scientific | S/3160/60 |
| KCl | BDH | BDH0258 |
| KOH | BDH | BDH0262 |
| Egg yolk emulsion | Sigma-Aldrich | 17148 |
| ME 2 diaphragm vacuum pump | Vacuubrand | 696126 |
| Steritop filters (Pore size: 0.22 μm, Neck size: 45 mm) | Millipore | SCGPT10RE |
| Luria-Bertani medium | Sigma | L2897 |
| 96-well microtitre plates | Sarstedt | 82.1581 |
| 24-well tissue culture-treated plates | Iwaki | 3820-024 |
| CampyGen gas generation packs | Oxoid | CN0025 |
| Microaerophilic chamber | Oxoid | HP0011 |
| Tobramycin sulphate | Sigma-Aldrich | T1783 |
| Cellulase, from Aspergillus niger | Sigma-Aldrich | 22178 |
| Resazurin | Sigma-Aldrich | 199303 |
| Citrate.H20 | BDH | BDH0288 |
| Fluostar omega microplate reader | BMG-Labtech | SPECTROstar Omega |
References
- Andrews, J. M. BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8). J. Antimicrob. Chemother. 64, 454-489 (2009).
- Worlitzsch, D. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. J. Clin. Invest. 109, 317-325 (2002).
- Smith, A. L., Fiel, S. B., Mayer-Hamblett, N., Ramsey, B., Burns, J. L. Susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa isolates and clinical response to parenteral antibiotic administration: lack of association in cystic fibrosis. Chest. 123, 1495-1502 (2003).
- Sriramulu, D. D., Lunsdorf, H., Lam, J. S., Romling, U. Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung. J. Med. Microbiol. 54, 667-676 (2005).
- Garbe, J. Characterization of JG024, a pseudomonas aeruginosa PB1-like broad host range phage under simulated infection conditions. BMC Microbiol. 10, 301 (2010).
- Naughton, S. Pseudomonas aeruginosa AES-1 exhibits increased virulence gene expression during chronic infection of cystic fibrosis lung. PLoS One. 6, e24526 (2011).
- Moskowitz, S. M., Foster, J. M., Emerson, J. C., Gibson, R. L., Burns, J. L. Use of Pseudomonas biofilm susceptibilities to assign simulated antibiotic regimens for cystic fibrosis airway infection. J. Antimicrob. Chemother. 56, 879-886 (2005).
- Field, T. R., White, A., Elborn, J. S., Tunney, M. M. Effect of oxygen limitation on the in vitro antimicrobial susceptibility of clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa grown planktonically and as biofilms. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 24, 677-687 (2005).
- Bjarnsholt, T. Pseudomonas aeruginosa biofilms in the respiratory tract of cystic fibrosis patients. Pediatr. Pulmonol. 44, 547-558 (2009).
- Hill, D. Antibiotic susceptibilities of Pseudomonas aeruginosa isolates derived from patients with cystic fibrosis under aerobic, anaerobic, and biofilm conditions. J. Clin. Microbiol. 43, 5085-5090 (2005).
- Fung, C. Gene expression of Pseudomonas aeruginosa in a mucin-containing synthetic growth medium mimicking cystic fibrosis lung sputum. J. Med. Microbiol. 59, 1089-1100 (2010).
- Andrews, J. M. BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8). The Journal of antimicrobial chemotherapy. 64, 454-489 (2009).
- Rybtke, M. T. The implication of Pseudomonas aeruginosa biofilms in infections. Inflamm Allergy Drug Targets. 10, 141-157 (2011).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O’Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulm. Pharmacol. Ther. 21, 595-599 (2008).
- Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. A new rapid and simple non-radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. J. Immunol. Methods. 170, 211-224 (1994).
- Fothergill, J. L. Effect of antibiotic treatment on bacteriophage production by a cystic fibrosis epidemic strain of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 426-428 (2011).
- Singh, P. K. Quorum-sensing signals indicate that cystic fibrosis lungs are infected with bacterial biofilms. Nature. 407, 762-764 (2000).
- Mowat, E. Pseudomonas Aeruginosa Population Diversity and Turnover in Cystic Fibrosis Chronic Infections. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. , (2011).
- Fothergill, J. L., Mowat, E., Ledson, M. J., Walshaw, M. J., Winstanley, C. Fluctuations in phenotypes and genotypes within populations of Pseudomonas aeruginosa in the cystic fibrosis lung during pulmonary exacerbations. J. Med. Microbiol. 59, 472-481 (2010).
- Fouhy, Y. Diffusible signal factor-dependent cell-cell signaling and virulence in the nosocomial pathogen Stenotrophomonas maltophilia. J. Bacteriol. 189, 4964-4968 (2007).
- Winstanley, C. Newly introduced genomic prophage islands are critical determinants of in vivo competitiveness in the Liverpool Epidemic Strain of Pseudomonas aeruginosa. Genome Res. 19, 12-23 (2009).
- Carter, M. E. A subtype of a Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis epidemic strain exhibits enhanced virulence in a murine model of acute respiratory infection. J. Infect. Dis. 202, 935-942 (2010).
