إعداد خلايا الفأر الجنينية الخلايا الليفية مناسبة للالإنسان التثقيف الجنينية والتي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة
Summary
تمليه نوعية الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEFs) عن طريق الضغط على الفأرة اليمين مثل CF-1. وينبغي أن تعدد القدرات الداعمة للMEFs وسائل الإعلام مكيفة (CM) التي تم الحصول عليها من هذه تحتوي على تركيزات الأمثل للActivin، عفريت وTgfβ1 اللازمة لActivin / العقدية ومسارات جمعية جيل المستقبل إلى تعاونية الحفاظ على الذات وتجديد تعدد القدرات.
Abstract
بشكل عام، الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والبشرية الناجمة عن الخلايا الجذعية المحفزة يمكن أن (hiPSCs) يمكن تربيتها 1 تحت ظروف متغيرة. ومع ذلك، فإنه ليس من السهل اقامة نظام فعال لزراعة هذه الخلايا. منذ الشروط ثقافة يمكن أن تؤثر على التعبير الجيني الذي يمنح تعدد القدرات في hESCs وhiPSCs، وتحسين وتوحيد أسلوب ثقافة أمر بالغ الأهمية.
وكان أول وصف لإنشاء خطوط hESC باستخدام MEFs كما الخلايا المغذية والجنين مصل بقري (FBS) المحتوية على ثقافة المتوسط 2. المقبل، واستعيض FBS مع استبدال خروج المغلوب المصل (KSR) وFGF2، مما يعزز انتشار hESCs 3. أخيرا، ونظم ثقافة التغذية الخالية من تمكن الخلايا في زراعة Matrigel المغلفة لوحات في KSR المحتوية على مكيفة المتوسطة (متوسطة مشروطا MEFs) 4. بعد ذلك، انتقلت الأوضاع ثقافة hESCs نحو ثقافة التغذية المجانية في defin كيميائياشروط إد 5-7. وعلاوة على ذلك، لتفادي تلوث محتمل من قبل مسببات الأمراض وطرق حيوان ثقافة البروتينات باستخدام xeno خالية من المكونات وضعت 8.
للحصول على تحسين ظروف قد تم استبدال الخلايا المغذية الماوس مع خطوط الخلايا البشرية (العضلات الجنين مثل خلايا الجلد و9، خلايا الجلد للبالغين 10، 11-12 الليفية القلفة، وخلايا اللحمة المتوسطة السلوي 13). ومع ذلك، فإن الحفاظ على كفاءة hESCs غير متمايزة باستخدام القلفة البشرية طبقات تغذية الخلايا الليفية المشتقة ليست مرتفعة كما أن من الخلايا المغذية الفأر نظرا لانخفاض مستوى إفراز Activin A 14. من الواضح، هناك فرق واضح في إنتاج عامل النمو عن طريق الماوس والخلايا المغذية الإنسان.
وكشفت التحليلات من transcriptomes من الفأر والخلايا المغذية الإنسان اختلافات كبيرة بين الخلايا الداعمة وغير الداعمة. الخارجية FGF2 أمر حاسم لmaintaiنينغ الذاتي تجديد hESCs وhiPSCs، وقد تم تحديدها على أنها أحد العوامل الرئيسية التي تنظم للتعبير عن Tgfβ1، وActivin والعفريت (أ خصم BMP) في الخلايا المغذية. وقد تبين Activin ألف للحث على التعبير عن OCT4، SOX2، وNANOG في hESCs 15-16.
على المدى الطويل ثقافة، ويمكن أن تنمو وhESCs hiPSCs على MEFs المعطل ميتوتيكلي] أو تحت تغذية خالية من الشروط في MEF-CM (MEF مكيفة متوسطة) على Matrigel المغلفة لوحات للحفاظ على دولتهم غير متمايزة. نجاح كل الشروط ثقافة تعتمد كليا على نوعية الخلايا المغذية، لأنها تؤثر بشكل مباشر على نمو hESCs.
هنا، نقدم أسلوب الأمثل للعزلة وثقافة من الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs)، وإعداد المتوسطة مكيفة (سم) وانزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA) لتقييم مستويات Activin وضمن وسائل الإعلام.
Protocol
Discussion
لإجراء العزل MEFs المقدمة هنا يمكن إنشاء حالة ثقافة موحدة لhESCs وhiPSCs. وعلاوة على ذلك النظام القائم على ELISA المستخدمة لتقييم إنتاج السيتوكينات من الخلايا المغذية هي مؤشر مفيد لنوعية وسائل الإعلام MEF المشتقة مكيفة. والصيانة الروتينية للسلالة الماوس (CF1) توفير الليفية دعم ضروري لتجنب دفعة إلى دفعة الاختلاف من وسائل الإعلام ثقافة. وعلاوة على ذلك، فمن المستحسن لعزل الأجنة من الفئران عدة في وقت واحد للحصول على نوعية متسقة من الخلايا. يمكن أن تظل معزولة MEFs بالتأكيد الطازجة المجمدة في P0 و P1. يمكن أن تظل MEFs المعطل أيضا المجمدة في aliquots كميات مناسبة اعتمادا على الاحتياجات اللازمة لزراعة الخلايا. وينبغي عادة أن ما يقرب من 250.000 مطلي الخلايا في بئر واحدة على لوحة 6 جيدا لhESCs ثقافة وخلايا الجذع. ويمكن وبالطريقة المحددة والأمثل تستخدم بشكل روتيني للحد من التباين بين diffeاستئجار التجارب.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
شكر خاص للدكتور بوريس Greber لإقامة Activin بروتوكول ELISA كما نشرت في Greber وآخرون عام 2007. نحن ممتنون بشكل خاص إلى السيدة مونيكا Shevack لإعداد لمحة عامة رسومية. نحن ممتنون جدا لشركة فوكس الدكتور هيكو للجميع العون واقتراحات قيمة من قبل وأثناء التصوير. نود أن نشكر جميع أعضاء مختبر Adjaye، خصوصا إليزابيث سوتشا للحفاظ على امدادات ثابتة من MEFs وCM. نعترف أيضا زملائنا في منشأة حيوان من MPIMG على دعمهم الدائم. وقد تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل جمعية ماكس بلانك و[BMBF؛ منح عدد 0315717A]، والشركاء من ERASysBio + مبادرة الدعم في إطار الاتحاد الأوروبي إيرانيت زائد مخطط في FP7.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM (High Glucose) | Gibco, Invitrogen | 41966-052 | |
| FBS | Biochrom | S0115 | |
| L-glutamine | Gibco, Invitrogen | 25030-024 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
| Vacuum filter system | Corning | 431097 | 500 ml, 0.22 μm, PAS |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Knockout DMEM | Gibco, Invitrogen | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco, Invitrogen | 10828-028 | |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco, Invitrogen | 11140-035 | |
| beta-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| PBS | Gibco, Invitrogen | 14190-169 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 100-18B | |
| Biotinylated Anti-human/mouse/rat Activin A Antibody | R&D Systems | BAM3381 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| Human/Mouse/Rat Activin A MAb | R&D Systems | MAB3381 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco, Invitrogen | 25300-054 | |
| Extra Thin Iris Scissors | FST | 14088-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | FST | 11150-10 | |
| Pierse Fixation Forceps | FST | 18155-13 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Amit, M. Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture. Dev. Biol. 227, 271-278 (2000).
- Xu, C. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Ludwig, T. E. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat. Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
- Yao, S. Long-term self-renewal and directed differentiation of human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6907-6912 (2006).
- Lu, J., Hou, R., Booth, C. J., Yang, S. H., Snyder, M. Defined culture conditions of human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 5688-5693 (2006).
- Skottman, H., Hovatta, O. Culture conditions for human embryonic stem cells. Reproduction. 132, 691-698 (2006).
- Richards, M., Fong, C. Y., Chan, W. K., Wong, P. C., Bongso, A. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).
- Richards, M. Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Stem Cells. 21, 546-556 (2003).
- Amit, M. Human feeder layers for human embryonic stem cells. Biol. Reprod. 68, 2150-2156 (2003).
- Inzunza, J. Derivation of human embryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells. Stem Cells. 23, 544-549 (2005).
- Zhang, K. Utilization of Human Amniotic Mesenchymal Cells as Feeder Layers to Sustain Propagation of Human Embryonic Stem Cells in the Undifferentiated State. Cell Reprogram. , (2011).
- Eiselleova, L. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int. J. Dev. Biol. 52, 353-363 (2008).
- Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. Fibroblast growth factor 2 modulates transforming growth factor beta signaling in mouse embryonic fibroblasts and human ESCs (hESCs) to support hESC self-renewal. Stem Cells. 25, 455-464 (2007).
- Vallier, L., Alexander, M., Pedersen, R. A. Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripotency of human embryonic stem cells. J. Cell Sci. 118, 4495-4509 (2005).
