Visualisatie van proprioceptoren in<em> Drosophila</em> Larven en poppen

Voordat u begint Groei van de gewenste vlieg culturen. De injectieflacons uncrowded (ongeveer 30 vliegen per 50 ml flacon). Laat de vliegen eitjes leggen voor slechts een dag in elke flacon. Dit zal de larven voldoende voedselvoorziening en hen in staat stellen om maximale grootte bereiken voordat kruipen uit het voedsel. Bewaar de injectieflacons in de juiste temperatuur tot derde instar larven beginnen te dwalen op de flacon muur. Bereid een nieuwe voorraad fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en PBT (0,1% Tween in PBS). Houd 10 ml PBS op ijs. Bereid 1-5 ml vers fixatief (4% Formaldehyde in PBT) en houdt het op ijs. We maken gebruik van gebotteld 37-38% formaldehyde als een stamoplossing. 1. Dissectie en fixatie van de derde Instar Larven Kies een zwervende derde instar larve van de flacon muur en plaats deze in een 50 ul druppel ijskoud PBS op een Sylgard dissectie plaat (gemaakt van Sylgard 184 siliconen elastomeer kit, Dow Corning Corporation in eenweefselkweek schotel). Houd de larve-, rug-kant naar boven, bij de monding haken, met fijn pincet (Dumont # 5 tang), en plak een insect pin (minutien, 0,1 mm, roestvrij staal) door middel van de hersenen van de larve's. Pak het achterste eind van de larve met de tang, trek en strek de larve zachtjes de lengte. Plak een ander insect pin tussen de twee achterste siphonen. Met behulp van de lente een schaar knippen twee horizontale insnijdingen in het lichaam muur (loodrecht op de anterior-posterior as), dicht bij de voorste en achterste pinnen. Met behulp van het voorjaar een schaar knip de larvale lichaam muur langs de dorsale middellijn van de voorste tot de achterste incisie. Verwijder de interne organen (darmen, speekselklieren, buisjes van Malpighi enz.) en de luchtpijp met behulp van fijne pincet. Was voorzichtig een of twee keer met PBS. Pak de twee lichaamswand kleppen met een pincet, rekken ze uit en ze op de plaat met behulp van twee insecten de spelden voor elke kant pin. Verwijder de PBS en voeg 50 ul fixeeroplossing (4% formaldehyde in PBT). Incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het fixeermiddel. Was tweemaal met PBS. Trek het insect pinnen. Met behulp van de lente een schaar knip de larvale kop en staart het verlaten van een rechthoekige filet. Breng de vaste weefsel tot een gekoelde Eppendorf buis met PBS. Als een voldoende aantal larven vastgesteld kan direct verder antilichaam kleuring. Als onmiddellijke kleuring niet gewenst is, moet de vaste larven worden gewassen 3 keer 5 minuten met 95% ethanol en opgeslagen in 95% ethanol bij -20 ° C. 2. Dissectie en Fixatie van Poppen Deel I Woon aan de flesjes als voor larven fixatie, tot derde instar larven beginnen te pupariate. Onderzoek de flacons elk uur en Mark larven die pupariated. Laat de gemarkeerde poppen tot 30-40 uur te ontwikkelen bij 24 ° C, of ​​24 tot 27 uur bij 29 ° C. Met behulp van fijne tang halen 20-30 poppen van ee juiste leeftijd en doe ze in een donkere porselein multi-goed ontleden schotel. Zorg ervoor dat u de weefsels van belang kunnen beschadigen. Pak de poppen uit de pop geval. Begin met het afpellen van het operculum en gaan door tot de pop is gratis. Zet de pop in een goed gevuld met PBT. Ga door het extraheren van alle poppen. Stappen 2.4-2.6 worden uitgevoerd in kleine groepen van vijf poppen tegelijk. Plaats vijf poppen op een vlakke ondergrond tussen de putten van het ontleden schotel. Een microdissectie te snijden het uiteinde van de kop en de achterste uiteinde van de buik (alternatief is het mogelijk om twee paar tang gebruiken gaten scheuren aan beide uiteinden van de poppen). Houd de pop op zijn plaats met behulp van fijne pincet en gebruik een 1 ml spuit om de reiniging van de interne organen van de pop, door het injecteren van PBT door de voorste opening. Was de ontleed pop kort door dompelen in een goed gevuld met PBS en verplaats het in de koude fixeermiddel in een Eppendorf buis op ijs bewaard. Incubeer nacht (ON) bij 4 ° C. Part II Gooi de fixatief en was de poppen drie keer, 5 minuten, met PBT. Houd de gewassen poppen op het ijs. Vul twee putjes van de schotel met het ontleden van PBT. Een polyetheen pasteurpipet overdracht verschillende poppen een van de putten. Verplaats een pop op een moment in de tweede put. Met behulp van twee paar scherpe pincet met perfect uitgelijnd tips, haal het transparante pop cuticula van de vleugel: zet de pop op de bodem van de put met behulp van een pincet, en voorzichtig scheuren de cuticula met behulp van het tweede paar pincetten. Zodra de cuticula is gescheurd, afschilferen van de vleugel. Zorg ervoor dat aan de vleugel los te koppelen van de pop. Na het afpellen van de cuticula van de vleugel mes, blijven het schillen van de cuticula van de vleugel scharnier (waar de vleugel chos zich bevinden). Na het afpellen van de vleugel cuticula, kan men proberen afpellen van het been cuticula op een vergelijkbare manier.Veel benen zijn waarschijnlijk verloren in het proces, maar ondanks de lage opbrengst, deze stap wordt ten zeerste aanbevolen, aangezien dit een aanzienlijke verbetering van de kleuring van het been chos. De chos van de haltere en de buik kunnen worden gevisualiseerd zonder verdere afpellen van de cuticula. Plaats het geschilde 'pop in een Eppendorf buis gevuld met methanol en houdt bij kamertemperatuur. Ga verder afpellen van de cuticula van alle poppen en voeg ze toe aan dezelfde buis. Ten minste 10 mooi geschild poppen moeten worden verzameld voor elke kleuring. Verwijder de methanol en was drie keer, 5 minuten, met 95% ethanol. Vaste poppen kan worden gehouden voor langere tijd in 95% ethanol bij -20 ° C. 3. Immunokleuring van larven en poppen Was de vaste weefsel PBT driemaal 30 minuten bij kamertemperatuur. Larven kunnen worden gewassen met zacht schudden op een roterende plaat. Poppen worden gewassen zonder schudden. Vervang de PBT met blokkerende buffer (PBT + 5% nEen normaal geit serum) en incubeer ON bij 4 ° C. Verwijder het blokkeren buffer en geïncubeerd met primaire antilichamen (verdund in blokkeringsbuffer) ON bij 4 ° C. Was viermaal uit met PBT zoals beschreven in stap 3.1. Verwijder het PBT en incubeer met secundaire antilichamen (verdund in blokkeringsbuffer) ON bij 4 ° C. Was twee keer met PBT en een keer met PBS, zoals beschreven in stap 3.1. Vervang de PBS met montage-medium (Dako Fluorescent Mounting Medium (Dako Cytomation, Glostrup, Denemarken) en incuberen bij 4 ° C ON. 4. Montage van Larven Larven zijn gemonteerd op een microscoop dia in een daling van de montage-media met hun nagelriem naar beneden en lichaamswand spieren naar boven. Doe een klein druppeltje montage medium op een schoon dekglas en gebruik deze om de voorbereiding te dekken. Gebruik geen druk uit op de gemonteerde larven. 5. Montage van Poppen Bereid twee objectglaasjesmet een druppel montagemedium, een voor dissectie en de tweede voor montage. Leg een aantal poppen op een van de dia's. Met behulp van de lente een schaar te verwijderen het hoofd en het achterste deel van de buik. Scheid de dorsale helft van de thorax van ventrale half door snijden van de vleugels en de poten. Plaats ontleed lichaamsdelen van de pop de tweede microscoopglaasje een druppel montage oplossing. Controleer de vleugels en de benen gespannen en proberen superpositie van weefsels zoveel mogelijk te beperken. Breng een druppel van de montage medium op een dekglas en plaats deze op het monster. Oefen geen druk uit op de gemonteerde monster. 6. Representatieve resultaten Een voorbeeld van immuno-gekleurde chos van Larve larve figuur 1. Dit voorbeeld toont een mooi gespannen buik-segment, waarin zeven van de acht chos zijn duidelijk zichtbaar. Neuronen zijn labeLED met MAb22C10 (1:20, verkregen uit de Developmental Studies Hybridoma Bank aan de Universiteit van Iowa), de cap, ligament, pet-gehechtheid en ligament bevestiging cellen zijn voorzien van anti-αTub85E (1:10, Klein et al.,. 2010). Secundaire antilichamen voor fluorescentiekleuring waren Cy3 of Cy5-geconjugeerd anti-mouse/rabbit (1:200, Jackson Immunoresearch Laboratories). Monsters werden bekeken met behulp van confocale microscopie (LSM 510, Zeiss). Een cluster vleugel chos de ventrale radiale ader van 35 uur oude pop is weergegeven in figuur 2. Figuur 1 (A) Schematische weergave van de zes celtypen die een Ch orgaan vormen. Kap aangebracht (CA), cap (C), scolopale (S), neuron (N), ligament (L) en ligament bevestiging (LA ). De LCh5 orgel, waarin vijf chos geclusterd, is uitgestrekt over de groep van de laterale dwarse spieren (LT1-4). De laterale lengterichting spier (LL1) ventrale longitudinale spieren (VL1-4) en laterale schuine spier (LO1) worden eveneens getoond. Tendon cellen worden geïllustreerd als bruine bollen (Genomen uit Klein et al.., 2010). (B) Een abdominale segment van een derde instar larve bekeken op een 10x vergroting. Zeven van de acht chos in elk abdominaalsegment zijn evident: vijf laterale organen die samen de pentascolopidial orgaan (LCh5) een laterale orgaan (LCh1) en een twee ventrale chos (VChB). De neuronen (N) van de chos zijn voorzien van de neuronale marker MAb 22C10 (rood). Het ligament (L), cap (C) en bevestiging cellen (LA, CA) zijn voorzien van anti-αTub-85E (blauw). De dop en ligament cellen bovendien voorzien van een CHO-specifieke GFP reporter herbergen van een reguleringselement van de dei locus (Nachman et al.., Ongepubliceerde gegevens). Figuur 2. </sTrong> De vleugel chordotonal organen aan de ventrale radiale ader worden bekeken op een 40x vergroting. De neuronen (N) zijn gemarkeerd met de neuronale marker 22C10 (Rood, B). Het ligament (L) en deksel (C) cellen samen gelabeld anti-αTub85E antilichamen (blauw, C) en CHO-specifieke GFP reporter transgene (Nachman et al.., Ongepubliceerde gegevens).