Fastställande av däggdjurscellinjer Räknar och cellstorlek och cell hälsa Använda Moxi Z Mini Automated Cell Counter
Summary
Den Moxi Z miniatyr automatiserad cellräknare är ett nytt instrument som kombinerar Coulter principen med patenterad tunn film sensorteknik och en proprietär programvara algoritm för att utföra dimensionering och räkning av ett brett storleksintervall av partiklar samt för att bestämma det allmänna hälsotillståndet i monodispers däggdjurscellkulturer. Detta protokoll beskriver användningen av detta instrument för att räkna och utvärdera hälsa cellkulturer.
Abstract
Partikel-och cellräkning används för en mängd tillämpningar inklusive rutin cellodling, hematologiska analyser och industrifastigheter 1-5. En kritisk genombrott i cell / partikelräkning teknik var utvecklingen av Coulter tekniken av Wallace Coulter över 50 år sedan. Tekniken involverar applicering av ett elektriskt fält över en mikrometerstorlek bländare och hydrodynamiskt fokusering enstaka partiklar genom öppningen. Den resulterande ocklusion av öppningen av partiklarna ger en mätbar förändring i elektrisk impedans som kan direkt och exakt korrelerade med cellstorlek / volym. Erkännandet av det tillvägagångssätt som riktmärke i cell / partikelräkning härrör från extra precision och noggrannhet av dess partikel storlek och räknas, särskilt i jämförelse med manuella och bildbehandling baserade tekniker (noggrannhet i storleksordningen 98% för Coulter räknare kontra 75 – 80% för manuella och vision-baserade system). Dettakan tillskrivas det faktum att till skillnad från imaging-baserade metoder för cellräkning gör Coulter Technique en äkta tredimensionell (3-D) mätning av celler och partiklar vilket dramatiskt minskar antalet störningar från skräp och klustring genom att beräkna exakta volymetrisk information om ca cellerna och partiklar. Sammantaget ger detta ett medel för räkning och dimensionering celler i en mer korrekt, mindre tråkiga, mindre tidskrävande och mindre subjektiva metoder än andra räknar tekniker 6.
Trots framträdande av Coulter tekniken i cell räkning har dess omfattande användning i rutinmässiga biologiska studier varit alltför grund av kostnaden och storleken på traditionella instrument. Även om en billigare Coulter styrmedel har producerats, har det begränsningar i förhållande till sina dyrare motsvarigheter i korrigeringen för "tillfällighet händelser" där två eller flera celler passerar genom öppningen och mäts samtidigt. Another begränsning med existerande Coulter tekniker är bristen på statistik på det allmänna hälsotillståndet i cellprover. Följaktligen måste ytterligare tekniker ofta användas tillsammans med Coulter-räkning för att bedöma cellviabilitet. Detta förlänger experimentuppställning tid och kostnad eftersom de traditionella metoderna för lönsamheten bedömning kräver cellfärgning och / eller användning av dyra och besvärliga utrustning såsom en flödescytometer.
Den Moxi Z Mini automatisk cellräknare, som beskrivs här är ett extremt litet bänk instrument som kombinerar noggrannhet Coulter principen med en tunn film sensorteknik för att exakt dimensionering och räkning av partiklar från 3-25 mikrometer, beroende på den cellräkning kassetten användas. M typ kassett kan användas för att räkna partiklar från med medeldiametrar av 4 – 25 mikron (dynamiskt område 2 – 34 mikrometer), och den typ S kassetten kan användas för att räkna partiklar med och genomsnittlig diameter av 3 – 20 mikrometer (dynamisk ringdee 2 – 26 mikrometer). Eftersom systemet använder en volymetrisk mätmetod, motsvarar de 4-25 mikrometer till en cellvolym intervallet 34 – 8180 fL och 3 – 20 mikrometer motsvarar en cellvolym intervallet 14 till 4200 FL, som är relevant när icke-sfärisk partiklar som mäts. Att utföra däggdjurscellinjer räknas med hjälp av Moxi Z är cellerna som skall räknas först spädas med ORFLO eller liknande utdrygningsmedel. En cellräkning kassett är införd i instrumentet, och provet laddas in i porten av kassetten. Tusentals celler dras, enda fil via en "Cell Sensing Zone" (CSZ) i den tunna film membran över 8-15 sekunder. Efter körningen använder instrumentet egenutvecklade kurvanpassning i samband med en proprietär programvara algoritm för att ge korrigering tillfällighet evenemanget tillsammans med en bedömning av den totala kulturen hälsa genom att bestämma förhållandet mellan antalet celler i populationen av intresse för det totala antalet partiklar. De totala partikelkoncentrationen inklue krympta och bryts ner döda celler, liksom andra skräp och föroreningar. Resultaten presenteras i histogrammet format med en automatisk kurvanpassning med grindar som kan justeras manuellt efter behov.
I slutändan möjliggör Moxi Z räkna med en precision och noggrannhet jämförbar med en Coulter Z2, den aktuella guldmyntfoten, samtidigt som ytterligare information kulturen hälsa. Dessutom uppnår dessa resultat på kortare tid, med en mindre fotavtryck, med betydligt enklare drift och underhåll, och till en bråkdel av kostnaden för jämförbara tekniker.
Protocol
Discussion
Den underliggande Genomförande Coulter tillvägagångssättet kan vara mycket deterministisk av den totala noggrannheten i mätningarna. Ett kritiskt område är att utjämna de de råa cell står för "tillfällighet evenemang" där två eller flera celler samtidigt passerar genom öppningen och mäts som en enda elektrisk händelse. "Tillfällighet händelser" bidra till fel som varierar beroende på ett antal faktorer, bland annat cellens storlek och graden av klustring (Davis et al 1967) 6. Som ett resultat kan den nödvändiga tillfällighet korrektion för varje givet prov inte förutsägas, varierande kraftigt mellan celler / partikel typer och även mellan olika kulturer identiska celltyper. Etablerad teori, rotad i första publikationer av Coulter, innebär tillämpning av en logaritmisk anpassning av de råvaror räknas baserat på antalet observerade händelser och ett empiriskt bestämd, partikel-specifik korrektionsfaktor Z. Medan exakta räknas kan väl uppnås med thans korrigering algoritm, är den begränsad i sin praktiska tillämpbarhet på grund av de stora variationerna i z-värden mellan celltyper och motsvarande svårigheter att exakt förutspå dess värde. Här med den "sanna" cell count identifieras av Moxi Z kurvanpassning i samband med sammanträffande korrigering algoritmen, korrigerar Moxi Z dynamiskt för tillfällighet att uppnå de verkliga koncentrationerna. Vid jämförelse med resultaten med high-end Coulter Z2, producerade Moxi Z jämförbara räknas över en koncentration mellan 0 – 500.000 celler / ml (typ M-kassett) och 3.000 – 2-2.5e 6 celler / ml (typ S kassett) . Dessutom uppnår Moxi Z räkna noggrannhet med en liknande låg variationskoefficienten för räknas och en precision i partikel storlek som är karakteristisk för guldmyntfoten, Coulter-teknik i cell räkning.
Dessutom data som presenteras här indikerar att Moxi Z kan ge värdefull informationom det allmänna hälsotillståndet i cellkulturer. Den Moxi Z utnyttjar kurvanpassningsförfarandet tillvägagångssätt med en proprietär programvara algoritm för att avgöra denna bedömning kultur hälsa. Morfologiska förändringar som förknippas med celldöd, såsom blåsbildning, bryta isär och volymetriska förvrängningar (Kataoka och Tsuruo 1996, Liegler et al 1995, Sheridan et al 1981) 12-14, att göra det möjligt för Moxi-Z för att skilja impedimetric skillnader mellan levande populationer och döda celler / skräp populationer. Den MVI genereras genom att analysera kultur / partikelstorleksfördelning att identifiera de relativa bidragen från partikel skräp, krympta nekrotiska celler och kurvan-monterade cellpopulation av intresse. Det MVI värdet motsvarar därmed en population index eller ratiometrisk mått på monodispersa befolkningen räknas med avseende på den totala partikeln befolkningen profil. Detta värde är sedan algoritmiskt-justeras baserat befolkningsstatistiken och empiriska observationer. BecausE MVI tittar på andra parametrar än traditionella färgning metoder, är det inte förväntas att spegla dessa tekniker utan ger ett värdefullt alternativ inblick i hälsa i en cell kultur, särskilt med avseende på skräp och föroreningar mikrobiella.
Sammanfattningsvis är Moxi-Z celltalsräknare en extremt liten bänk instrument som ger exakta, reproducerbara analyser av celltal, cell storlek och cell hälsa med hjälp av Coulter Princip och kurvanpassning algoritmer programvara i kombination med en patenterad tunn film sensorteknik . Med Typ M kassetten är i stånd att räkna partiklar som sträcker sig från 4 – 25 mikron i diameter (dynamiskt område av 2 – 34 mikron), i 8 sekunder. Med Typ S kassetten är i stånd att räkna partiklar varierande från 3 – 20 mikrometer i diameter (dynamiskt område av 2 – 26 mikron), i 15 sekunder. Vidare utför Moxi-Z hälsoundersökning utan användning av reagens. Det är mycket mindre arbetskraft integreradensive och subjektiva än manuell räkning. I jämförelse med vanlig Coulter räkningen är Moxi snabbare, betydligt mindre, ger mer information, kräver betydligt mindre underhåll, är lättare att använda och är en bråkdel av kostnaden.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| ORFLO Diluent | ORFLO | MXA006 | |
| Cassette Dispenser | ORFLO | Stores up to 25 cassettes for convenient dispensing | |
| USB Cable | ORFLO | Connects instrument to PC/Mac or power adapter | |
| Power Adapter (US and EU models only) | ORFLO | Connects USB cable to an AC outlet | |
| USB Flash Drive | ORFLO | Stores Moxi Z software and user manual | |
| Calibration Check Beads | ORFLO | ||
| Electronic Calibration Cassette | ORFLO | Electronic cassette for verifying proper system operation and calibration |
References
- Fernyhough, M. E., Helterline, D. L., Vierck, J. L., Hill, R. A., Dodson, M. V. Coulter counter use in the enumeration of muscle and fat stem cells. Methods. Cell. Sci. 25, 221-225 (2003).
- Blades, A. N., Flavell, H. C. Observations on the use of the Coulter model D electronic cell counter in clinical haematology. J. Clin. Pathol. 16, 158-163 (1963).
- Morris, T. M. Particle Size Analysis of Beer Solids using a Coulter Counter. J. Inst. Brew. 90, 162-166 (1984).
- Marth, E. H. Electronic Somatic Cell Counting Procedure. Standard Methods for the Examination of Dairy Products. , 134-140 (1978).
- Parks, L. R., Jurbergs, K. A. Number and size distribution of particles in cellulosic solutions. J. Appl. Polym. Sci. 11, 193-199 (1960).
- Davis, R. E., Green, R. E. Automatic platelet counting with the Couler particle counter. J. Clin. Pathol. 20, 777-779 (1967).
- Dittami, G. D., Rabbitt, R. D. Electrically evoking and electrochemically resolving quantal release on a microchip. Lab on a Chip. 10, 30-35 (2010).
- Nahreini, P., Hanson, A., Prasad, K. High-yield production of recombinant antibody fragments in HEK-293 cells using sodium butyrate. BioTechiques. 34, 968-972 (2003).
- Escuyer, V., Collier, R. J. Anthrax Protective Antigen Interacts with a Specific Receptor on the surface of CHO-K1 Cells. Infection and Immunity. 59, 3381-3386 (1991).
- Isaacs, R. D. Borrelia bugdorferi bind to epithelial cell proteoglycans. J. Clin. Invest. 93, 809-819 (1994).
- Saito, Y., Takahashi, K. Characterization of selenoprotein P as a selenium supply protein. Eur. J. Biochem. 269, 5746-5751 (2002).
- Kataoka, S., Tsuruo, T. Physician Education: Apoptosis. Oncologist. 1, 399-401 (1996).
- Liegler, T. J., Hyun, W., Yen, T. S., Stites, D. P. Detection and quantification of live, apoptotic, and necrotic human peripheral lymphocytes by single-laser flow cytometry. Clin. Diagn. Lab Immunol. 2, 369-376 (1995).
- Sheridan, J. W., Bishop, C. J., Simmons, R. J. Biophysical and morphological correlates of kinetic change and death in a starved human melanoma cell line. J. Cell. Sci. 49, 119-137 (1981).
- Dittami, G. M., Rabbitt, R. D., Ayliffe, H. E. ORFLO Moxi Z: Revolutionizing electronic cell count accuracy and cell viability estimates through curve fitting. Life Science Magazine, VWR International. , (2011).
