Determinazione del conteggio delle cellule dei mammiferi, le dimensioni delle cellule e la salute delle cellule utilizzando il Moxi Z Mini contaglobuli automatizzato

1. Preparazione di campioni Diluire la sospensione cellulare con ORFLO diluente o un diluente appropriato in modo che la concentrazione cellulare è all'interno del campo di funzionamento dello strumento (da 3.000 a 500.000 cellule / ml per cassette di tipo M, o 3.000 a 2.500.000 cellule / ml per cassette Type S). Una diluizione di 1:05-01:20 (tipo cassette M) o nessuna diluizione per diluizione 1:5 (cassette Type S) è consigliata per linee cellulari la maggior parte dei mammiferi, ma la diluizione appropriata dipenderà dal tipo di cellula e densità di semina. Il volume richiesto per un conteggio preciso è di circa 75 pl. 2. Di utilizzare i campioni Girare la Z Moxi premendo il pulsante di accensione e la schermata iniziale verrà visualizzata. Premere il vassoio e inserire una cassetta nel Z. Moxi Il campione Pipettare 75μL … Verrà visualizzata la schermata. Pipettare un campione di 75 microlitri nella porta di riempimento della cassetta (ovale bluetichettati 1 o 2, a seconda estremità della cassetta è stata inserita nello strumento). Queste sono le cassette monouso, che possono essere utilizzati per 2 test. Nota: Posizionare la punta della pipetta direttamente nel caricamento bene a ~ 45 ° angolo in modo che la punta e 'colto sotto il bordo anteriore del bene. Quando erogazione, è importante che il vuoto non "andare avanti" della erogazione del fluido come potrebbe causare sacche d'aria di entrare la cassetta. Si raccomanda di avere un piccolo tallone (la dimensione di entrata e) di forma fluida sul pozzo durante l'erogazione. Per il conteggio delle cellule di mammifero più, toccare lo schermo per iniziare ovunque. Per il conteggio delle particelle molto piccole (da 4 a 8 micron diametro medio per Tipo M e 3-8 micron di diametro medio di Type S), la Z Moxi può essere eseguito in modalità di particelle di piccole dimensioni. Nota: il tipo di cassetta viene indicato nella barra nera nella parte superiore dello schermo. In questo modo, Moxi Z determina la scala di diametro da 2 a 10 um come predefinito ed esegue il conteggio ucantare parametri ottimizzati per il rilevamento di piccole cellule. Premere il piccolo pulsante TOUCH QUI Modalità di particelle (nero quadrato) per avviare ed eseguire il test in questa modalità. La Z Moxi inizierà il test ed i risultati delle celle di conteggio sarà completato in circa 8 secondi (tipo cassette M) o 15 secondi (cassette Type S). Il Curve Fitting e calcoli MVI iniziare automaticamente e richiede solo pochi secondi supplementari. Quando un accoppiamento idoneo viene trovato, i risultati vengono automaticamente visualizzato sullo schermo. Per rendere Gating modalità di acquisizione predefinita, premere il tasto Count Curve Fit per passare in modalità Gating. A questo punto la cassetta può essere rimosso dall'unità. 3. Gestione dei dati Se il ridimensionamento AutoMode è spento, i risultati vengono visualizzati inizialmente per un conteggio curva di adattamento su una scala diametro di 2-34 micron (tipo cassette M) o 2-26 μm (cassette Type S). Se il ridimensionamento Automode è, allora il Z Moxi automaticamente scala l'asse orizzontale (asse x) per l'intervallo che è più vicina alla larghezza della curva-fit popolazione garantendo nel contempo tutti curva-fit dati visualizzati. Se il ridimensionamento AutoMode è spento, per visualizzare manualmente i risultati a una risoluzione più alta, toccare l'icona di 2-26 micron (Tipo M) o l'icona di 2-18 micron (Type S). Nota: Il tipo di cassetta viene indicato nella casella blu in alto a sinistra dello schermo. Questa opzione è consigliata quando si contano più piccole cellule o particelle per migliorare sia le curve-fitting funzionalità nonché la capacità dell'utente di discriminare visivamente sfumature dei dati. Su aumentare la risoluzione orizzontale, il pulsante di scala regola dinamicamente per consentire il ciclismo tra i disponibili x-asse campi scala: 2-34, 2-26 e 2-18 e 2-10 micron per il cassetto di tipo M o 2 -26, 2-18 e 2-10 micron per cassette del tipo S. Questa funzione è solo dispobile immediatamente dopo un numero di celle. Contare le informazioni (cellule / ml) per la curva-fit o regione gated viene visualizzato in una scatola nera sotto il lato sinistro dell'istogramma. Informazioni media dimensione della cella viene visualizzata nella scatola nera sul lato destro dell'istogramma. Il valore MVI viene visualizzato un riquadro blu in alto a destra dell'istogramma. Se il test è stato eseguito in modalità piccola particella, il MVI non si applica e verrà visualizzata come "MVI = SPM". Inoltre, se la concentrazione di cellule è al di fuori del campo di funzionamento MVI, un messaggio di "MVI = Out of Range" sarà visualizzato. Per salvare l'istogramma corrente, toccare l'icona Fatto. Ciò consente di risparmiare i dati con il nome di "Test XXX" dove XXX è il numero di test corrispondente. Per cancello manualmente l'istogramma, toccare per far passare la Fit Curve conteggio risultati pulsante. Ciò rende Gating modalità di acquisizione predefinita. Quindi, far scorrere ciascun indicatore blu gating per impostare le porte o toccare thle frecce destra e sinistra di e (queste appaiono dopo aver toccato l'indicatore blu gating) per le regolazioni fini del cancello solo le celle comprese tra i marcatori sono contati. La scala istogramma verticale viene automaticamente ridotta basa sulla curva-fit ampiezza popolazione. Per regolare questa scala verticale, scorrere lo schermo verso l'alto o verso il basso nella regione istogramma. Toccare il tasto Gated Count risultati per riportare il display in modalità curva in forma e fare modalità curva di adattamento la modalità di acquisizione predefinita. Quindi premere l'icona Fine per salvare i risultati e tornare alla schermata Home. Per eliminare i risultati, premere sul pulsante Elimina in qualsiasi momento per eliminare definitivamente i risultati del test. 4. Analisi dei dati precedentemente acquisiti Per aprire un test salvato, premere l'icona Istogramma sulla schermata Home. Icone per un massimo di nove istogrammi salvate verranno visualizzate sullo schermo.Premere l'icona appropriata per il test di interesse o premere il pulsante Pagina su o Pagina giù icone per visualizzare i risultati dei test più. Ogni istogramma sarà aperto in entrambe le modalità di Conte Adattamento curva o in modalità Count Gated, a seconda di come è stato salvato. In modalità Count Gated, marcatori gating può essere posizionato a piacimento facendo scorrere ciascun indicatore blu gating in modo indipendente. Porta Auto toccando il picco desiderato. Toccare per passare tra il Conte e la Curva Gated modalità Count Fit. Premere le icone Zoom e Unzoom per regolare la scala verticale dell'istogramma. La scala verticale può essere modificato anche in senso verticale strisciando il dito sul up display (per aumentare) o verso il basso (per diminuire). Premere l'icona Delete per eliminare definitivamente i risultati del test. Premere l'icona Fine perchiudere i risultati del test e tornare alla schermata Home. (Nota: vista ingrandita non verranno salvate.) 5. Trasferimento dati su un PC I dati possono essere trasferiti a un PC utilizzando l'applicazione Moxichart Orflo o tramite bonifico USB collegando il Moxi Z cavo USB a un PC o Mac. Per il trasferimento Bluetooth (MoxiChart), in primo luogo determinare ID Bluetooth dell'unità premendo l'icona Bluetooth nella schermata iniziale del gruppo Moxi Z. Sul computer, aprire l'applicazione MoxiChart e fare clic sull'icona Bluetooth in alto a destra. Quindi, scegliere il dispositivo che corrisponde alla ID Bluetooth del Z Moxi e selezionare una cartella di destinazione per i file caricati. Moxichart trasferirà automaticamente tutti i file nella directory specificata tramite la connessione Bluetooth. I file trasferiti via Bluetooth (MoxiChart) o USB può essere aperto e analisized direttamente con l'applicazione MoxiChart o, perché sono formattati. file CSV, possono essere aperti direttamente in Microsoft Excel o altri programmi di analisi dei dati per l'analisi in aggiunta / custom. 6. Risultati rappresentativi Per valutare la precisione e l'accuratezza della Z Moxi, conta di cellule HEK-293, le cellule HeLa e CHO-K1, lievito, Jurkat E6-1 le cellule, le cellule PC12 e precisione calibrata sospensioni tallone con concentrazioni che vanno da 0-500,000 cellule / mL (Type cassetta M) e 0-2-2.5E 6 cellule / ml (cassetta tipo S) sono state contate e confrontate con Coulter Z2 e la Z. Moxi Tutte le cellule di mammifero sono stati ottenuti dalla American Type Culture Collection (ATCC) e coltivate come precedentemente descritto 7-11. Brevemente, le cellule sono state coltivate in sospensione in 75 palloni di coltura tissutali mm 2 con mezzi principali di RPMI 1640 (Jurkat E6-1, PC12), MEM (HEK-293, HeLa) cellule, o F12K (CHO-K1) cellule. Tutti i media è stata integrata con10% di siero fetale bovino e 100 U penicillin/100 Streptomicina pg. Beute sono state mantenute in un incubatore a 37 ° C con 5% CO 2. Le cellule sono state diversi passaggi ogni 3 giorni. Cellule di lievito (X5, C. albicans, Vin 13) sono stati donati e utilizzato immediatamente, come previsto. Concentrazioni di campione iniziale di ~ 500.000 cellule / ml per i dati di tipo M cassette e ~ 2-2.5E 6 cellule / ml per le cassette del tipo S sono stati stabiliti utilizzando il Coulter Z2. Successivi livelli di concentrazione teoriche sono state preparate mediante diluizioni seriali con buffer fisiologici (ISOTON II o soluzione salina bilanciata di Hank). A ciascuna concentrazione, campioni identici sono stati misurati da entrambi i sistemi e tracciati contro l'altro. Come si vede nella figura 2, vi era una forte correlazione lineare (Tipo M r 2> 0,9886, di tipo S r 2> 0,9781) tra i conteggi per tutti i campioni. Le concentrazioni sono state anche rispetto alle attese / teorica concentrazione cellulare sia con il Moxi Z e Z2 ( <strong> Figura 3) e ancora una volta hanno dimostrato forti correlazioni lineari (tipo M r 2> 0,9758, Type S r 2> 0,9774). Per valutare la precisione, HEK-293 e conta di cellule HeLa sono state eseguite usando la Z2 Coulter, Moxi Z, e un emocitometro. Il coefficiente medio di variazione (CV, n = 19) della conta di cellule utilizzando la Z Moxi (tipo cassette M), Coulter Z2 e un emocitometro sono stati calcolati con CV è misurata dal 5 punti distinti negli 200.000-300.000 cellule / ml gamma. Il piccolo medio CV (Figura 4) del Z Moxi è paragonabile a quella del Z2 ed è rappresentativo del livello di precisione ottenibile solo con tecnologie basate conteggio Coulter. Dimensionamento di precisione dello strumento Moxi Z è stata valutata il prossimo attraverso la misurazione del acquistati, perle di polistirene di precisione calibrati. Misurazioni medie dimensione delle particelle (n = 5) da Moxi Z sono state rilevate in dimensioni produttore segnalati. Come si può vedere in figura 5, le misurazioni Z Moxi matching i valori produttore con un'alta correlazione lineare (r 2 = 0,9989). Oltre a informazioni su dimensioni e numero, Moxi Z fornisce un reagente-free, la valutazione generale di salute dei mammiferi coltura cellulare con un indice di vitalità riportato Moxi (MVI) valore. Questo indice è generato da un rapporto tra il numero di cellule nella popolazione di interesse rispetto ai conteggi totali di particolato. Per dimostrare le capacità di misurazione MVI, letture MVI (tipo cassette M) sono stati confrontati al manuale standard e flussocitometrici Live / Dead tecniche di misurazione. Popolazioni di morti (<10% vitali) HEK-293 e cellule HeLa sono state create per mezzo di incubazione overnight delle cellule vive in un nutriente-free, fluoruro di sodio contenente diluente (ISOTON II, Beckman Coulter) a 37 ° C. Controllati i livelli di vitalità teorici sono stati preparati da ratiometrically concentrazioni mescolando note di cellule vive e morte. Resulting soluzioni sono state analizzate per i livelli di redditività in duplicato con entrambi i conteggi e le misurazioni emocitometro citometro a flusso. Misurazioni emocitometro state effettuate utilizzando un tradizionale miscela 50/50 del 0,1% soluzione Trypan Blue e cellule. Misurazioni di citometria a flusso sono state effettuate utilizzando un citometro Guava PCA (Merck) usando il reagente Viacount e il fabbricante-specificato protocollo (Merck). Come mostrato in figura 6, i valori di correlazione di Pearson (r 2) "del fit lineare dei dati MVI a percentuali analoghe vitalità emocitometro per" cellule HEK e cellule HeLa sono state r 2 = 0,9937 e R 2 = 0,9728, rispettivamente. Questi risultati dimostrano che questo approccio fornisce informazioni sulla salute della cultura in una vasta gamma di cellulari Viabilità che confrontano favorevolmente le misure Live / Dead ottenuti utilizzando un citometro a flusso o emocitometro. Tabelle e figure (Da Dittami et al, 2011.) 15: <p class= "Jove_content"> Figura 1. A film sottile Conteggio Coulter: La corrente elettrica viene fatta passare attraverso la zona di rilevamento della cella a film sottile cassetta. Mentre le cellule fluire unico file attraverso il CSZ, gli aumenti momentanei di tensione sono misurati dalla Z. Moxi Figura 2. Moxi conteggi Z sono paragonabili a Coulter Z2 conteggi. Conteggi identici di sospensioni cellulari e tallone sono stati contati utilizzando sia un Coulter Z2 e la Z. Moxi valori medi di conteggio (n = 3-4) dei conteggi Z Moxi sono stati tracciati rispetto al Coulter Z2 corrispondenti conti e 2 r valori del fit lineare sono stati determinati. A) cassette di tipo M – intervallo di concentrazione 0 – 500.000 cellule / ml. B) cassette di tipo S – intervallo di concentrazione di 0 – 2-2.5E 6 / Bar ml.Error indicano ± 1 deviazione standard. <p class="jove_content"> Figura 3. Moxi misure di concentrazione Z vs concentrazioni cellulari teorici. A) cassette di tipo M – I valori di concentrazione teorici sono stati preparati da diluizioni seriali di un primo campione di 500.000 cellule / ml B) cassette di tipo S -. Valori di concentrazione teorici sono stati preparati da diluizioni seriali di un iniziale 2 – 2.5E 6 cellule / ml di campione. Barre di errore indicano ± 1 deviazione standard. Figura 4. Coefficiente di variazione per la Z2 Coulter, Moxi Z (tipo cassette M), e emocitometro. Il coefficiente medio di variazione (CV, n = 19) di HEK-293 e conta delle cellule HeLa per ciascun approccio sono stati calcolati con i CV misurati da separato da 5 conti di HEK-293 e cellule HeLa in 200.000 – 300.000 cellule / ml gamma. Barre di errore indicano ± 1 deviazione standard. <p class = "jove_content"> Figura 5. Precisione di misurazione delle dimensioni delle particelle che utilizzano Moxi Moxi Z-Z misurata dimensione tallone (tipo cassette M) vs produttore riportato dimensioni tallone. Barre di errore indicano ± 1 deviazione standard. Figura 6. Cultura della valutazione della sanità con MVI – Confronto di misure di MVI (tipo cassette M) e Guava PCA vitalità Viacount rispetto visive, trypan-blu conta vitalità colorarle con un emocitometro.