स्तनधारी सेल काउंट्स, सेल आकार और सेल स्वास्थ्य Moxi Z मिनी स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग का निर्धारण
Summary
Moxi Z लघु स्वचालित सेल काउंटर एक उपन्यास साधन है कि पेटेंट सेंसर पतली फिल्म प्रौद्योगिकी और एक मालिकाना सॉफ्टवेयर एल्गोरिथ्म करने के लिए आकार देने वाले प्रदर्शन के साथ और कणों का एक व्यापक रेंज आकार की गिनती के रूप में के रूप में अच्छी तरह लिए monodisperse के समग्र स्वास्थ्य का निर्धारण कल्टर सिद्धांत को जोड़ती है स्तनधारी सेल संस्कृतियों. यह प्रोटोकॉल गिनती और सेल संस्कृतियों के स्वास्थ्य का आकलन करने के लिए इस उपकरण के उपयोग का वर्णन करता है.
Abstract
Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A critical breakthrough in cell/particle counting technologies was the development of the Coulter technique by Wallace Coulter over 50 years ago. The technique involves the application of an electric field across a micron-sized aperture and hydrodynamically focusing single particles through the aperture. The resulting occlusion of the aperture by the particles yields a measurable change in electric impedance that can be directly and precisely correlated to cell size/volume. The recognition of the approach as the benchmark in cell/particle counting stems from the extraordinary precision and accuracy of its particle sizing and counts, particularly as compared to manual and imaging based technologies (accuracies on the order of 98% for Coulter counters versus 75-80% for manual and vision-based systems). This can be attributed to the fact that, unlike imaging-based approaches to cell counting, the Coulter Technique makes a true three-dimensional (3-D) measurement of cells/particles which dramatically reduces count interference from debris and clustering by calculating precise volumetric information about the cells/particles. Overall this provides a means for enumerating and sizing cells in a more accurate, less tedious, less time-consuming, and less subjective means than other counting techniques6.
Despite the prominence of the Coulter technique in cell counting, its widespread use in routine biological studies has been prohibitive due to the cost and size of traditional instruments. Although a less expensive Coulter-based instrument has been produced, it has limitations as compared to its more expensive counterparts in the correction for “coincidence events” in which two or more cells pass through the aperture and are measured simultaneously. Another limitation with existing Coulter technologies is the lack of metrics on the overall health of cell samples. Consequently, additional techniques must often be used in conjunction with Coulter counting to assess cell viability. This extends experimental setup time and cost since the traditional methods of viability assessment require cell staining and/or use of expensive and cumbersome equipment such as a flow cytometer.
The Moxi Z mini automated cell counter, described here, is an ultra-small benchtop instrument that combines the accuracy of the Coulter Principle with a thin-film sensor technology to enable precise sizing and counting of particles ranging from 3-25 microns, depending on the cell counting cassette used. The M type cassette can be used to count particles from with average diameters of 4 – 25 microns (dynamic range 2 – 34 microns), and the Type S cassette can be used to count particles with and average diameter of 3 – 20 microns (dynamic range 2 – 26 microns). Since the system uses a volumetric measurement method, the 4-25 microns corresponds to a cell volume range of 34 – 8,180 fL and the 3 – 20 microns corresponds to a cell volume range of 14 – 4200 fL, which is relevant when non-spherical particles are being measured. To perform mammalian cell counts using the Moxi Z, the cells to be counted are first diluted with ORFLO or similar diluent. A cell counting cassette is inserted into the instrument, and the sample is loaded into the port of the cassette. Thousands of cells are pulled, single-file through a “Cell Sensing Zone” (CSZ) in the thin-film membrane over 8-15 seconds. Following the run, the instrument uses proprietary curve-fitting in conjunction with a proprietary software algorithm to provide coincidence event correction along with an assessment of overall culture health by determining the ratio of the number of cells in the population of interest to the total number of particles. The total particle counts include shrunken and broken down dead cells, as well as other debris and contaminants. The results are presented in histogram format with an automatic curve fit, with gates that can be adjusted manually as needed.
Ultimately, the Moxi Z enables counting with a precision and accuracy comparable to a Coulter Z2, the current gold standard, while providing additional culture health information. Furthermore it achieves these results in less time, with a smaller footprint, with significantly easier operation and maintenance, and at a fraction of the cost of comparable technologies.
Protocol
Discussion
अंतर्निहित कार्यान्वयन कल्टर दृष्टिकोण अत्यधिक माप के समग्र सटीकता के नियतात्मक हो सकता है. "संयोग घटनाओं जहां एक साथ दो या अधिक कक्षों एपर्चर के माध्यम से पारित कर रहे हैं और एक भी बिजली घटना के रूप में मापा के लिए कच्चे सेल गिनती के एक महत्वपूर्ण क्षेत्र में सुधार है. "संयोग घटनाओं" त्रुटि है जो सेल आकार और क्लस्टरिंग की डिग्री (डेविस एट अल 1967) 6 सहित कारकों की एक संख्या पर निर्भर करता है के लिए योगदान एक परिणाम के रूप में, किसी भी नमूने के लिए आवश्यक संयोग सुधार किया जा भविष्यवाणी नहीं की सेल / कण प्रकार के बीच व्यापक रूप से और भी समान सेल प्रकार के अलग अलग संस्कृतियों के बीच अलग कर सकते हैं. सिद्धांत, कल्टर द्वारा प्रारंभिक प्रकाशनों में निहित की स्थापना की, कच्चे मनाया घटनाओं और एक अनुभव से निर्धारित कण विशेष सुधार कारक, Z की संख्या के आधार पर गिनती के एक लघुगणक समायोजन के आवेदन शामिल है. जबकि सही मायने रखता है ठीक से टी के साथ हासिल की जा सकता हैउसके सुधार एल्गोरिथ्म है, यह इसके व्यावहारिक प्रयोज्यता कोशिका प्रकार और सही रूप में इसके मूल्य की भविष्यवाणी में इसी कठिनाई के बीच z के मूल्यों में बड़े बदलाव के कारण में सीमित है. यहाँ, "सच" सेल Moxi Z वक्र ढाले संयोग सुधार एल्गोरिथ्म के साथ संयोजन के रूप में पहचान की गिनती का उपयोग कर, Moxi Z गतिशील संयोग सच सांद्रता को प्राप्त करने के लिए सही है. 500,000 कोशिकाओं / मिलीलीटर (प्रकार एम कैसेट) और 3,000 – 2 – 2.5e 6 कोशिकाओं / एमएल (एस प्रकार कैसेट) जब उच्च अंत कल्टर Z2 का उपयोग कर परिणाम प्राप्त की तुलना में, Moxi जेड 0 के एक एकाग्रता रेंज भर में तुलनीय मायने रखता है का उत्पादन . इसके अलावा, Moxi Z भिन्नता के मायने में एक समान कम गुणांक और कण आकार में एक सटीक है कि सोने के मानक, सेल गिनती में कल्टर तकनीक की विशेषता है के साथ इस गणना सटीकता प्राप्त होता है.
इसके अलावा, यहाँ प्रस्तुत आंकड़ों से संकेत मिलता है कि Moxi Z बहुमूल्य जानकारी प्रदान कर सकते हैंसेल संस्कृतियों के समग्र स्वास्थ्य के बारे में Moxi Z एक मालिकाना सॉफ्टवेयर इस संस्कृति स्वास्थ्य मूल्यांकन निर्धारित एल्गोरिथ्म के साथ वक्र ढाले दृष्टिकोण का लाभ उठाता है. Morphological कोशिका मृत्यु के साथ जुड़े blebbing के रूप में, परिवर्तन, अलग तोड़ने, और बड़ा विकृतियों (Kataoka और Tsuruo 1996, Liegler एट अल, 1995 Sheridan एट अल 1981) 12-14, यह संभव Moxi-Z impedimetric मतभेद के बीच भेद करने के लिए बनाने के लिए आबादी और मृत सेल / मलबे आबादी रहते हैं. MVI आकार / संस्कृति कण वितरण का विश्लेषण लिए कण मलबे के रिश्तेदार योगदान, सिकुड़ा हुआ परिगलित कोशिकाओं, और वक्र सज्जित ब्याज की सेल की आबादी की पहचान के द्वारा उत्पन्न होता है. MVI मूल्य जिससे आबादी या समग्र कण जनसंख्या प्रोफ़ाइल के लिए सम्मान के साथ monodisperse जनसंख्या की गिनती के ratiometric उपाय सूचकांक दर्शाता है. यह मान तो है algorithmically समायोजित आधारित जनसंख्या के आँकड़े और अनुभवजन्य टिप्पणियों. Becausई MVI पारंपरिक धुंधला दृष्टिकोण से अन्य मानकों पर दिखता है, यह करने के लिए इन तकनीकों दर्पण की उम्मीद नहीं है लेकिन बजाय एक सेल संस्कृति के स्वास्थ्य में एक मूल्यवान विकल्प देखने के मलबे और सूक्ष्म contaminants के सम्मान के साथ विशेष रूप से प्रदान करता है.
सारांश में, सेल Moxi जेड काउंटर एक अति लघु benchtop साधन है कि सटीक, सेल गिनती की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, assays सेल आकार, और सेल स्वास्थ्य कल्टर सिद्धांत और वक्र ढाले सॉफ्टवेयर एल्गोरिदम एक पेटेंट सेंसर पतली फिल्म प्रौद्योगिकी के साथ संयुक्त का उपयोग प्रदान करता है . आठ सेकंड में, व्यास में 25 microns (34 माइक्रोन 2 की गतिशील रेंज -) प्रकार एम कैसेट के साथ यह 4 से लेकर कणों गिनती करने में सक्षम है. 15 सेकंड में, व्यास में 20 microns (26 माइक्रोन 2 की गतिशील रेंज) एस प्रकार के कैसेट के साथ यह 3 से लेकर कणों गिनती करने में सक्षम है. इसके अलावा, Moxi Z अभिकर्मकों के उपयोग के बिना स्वास्थ्य आकलन करता है. यह बहुत कम श्रम क ¥nsive और मैनुअल गिनती से व्यक्तिपरक है. मानक कल्टर गिनती तुलना में, Moxi तेजी है, काफी छोटे, अधिक सूचना प्रदान करता है, काफी कम रखरखाव की आवश्यकता है, आसान है का उपयोग करने, और लागत का एक अंश
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| ORFLO Diluent | ORFLO | MXA006 | |
| Cassette Dispenser | ORFLO | Stores up to 25 cassettes for convenient dispensing | |
| USB Cable | ORFLO | Connects instrument to PC/Mac or power adapter | |
| Power Adapter (US and EU models only) | ORFLO | Connects USB cable to an AC outlet | |
| USB Flash Drive | ORFLO | Stores Moxi Z software and user manual | |
| Calibration Check Beads | ORFLO | ||
| Electronic Calibration Cassette | ORFLO | Electronic cassette for verifying proper system operation and calibration |
References
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