Détermination du nombre de cellules de mammifères, taille des cellules et la santé des cellules à l'aide du Moxi Mini Z Compteur de cellules automatisé
Summary
Le Moxi Z miniature compteur de cellules automatisé est un nouvel instrument qui combine le principe Coulter avec la technologie brevetée du capteur à couche mince et d'un algorithme logiciel propriétaire pour effectuer le calibrage et le comptage d'une gamme de taille large de particules ainsi que pour déterminer la santé globale de monodisperse cultures de cellules de mammifères. Ce protocole décrit l'utilisation de cet instrument pour le comptage et l'évaluation de la santé des cultures cellulaires.
Abstract
Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A critical breakthrough in cell/particle counting technologies was the development of the Coulter technique by Wallace Coulter over 50 years ago. The technique involves the application of an electric field across a micron-sized aperture and hydrodynamically focusing single particles through the aperture. The resulting occlusion of the aperture by the particles yields a measurable change in electric impedance that can be directly and precisely correlated to cell size/volume. The recognition of the approach as the benchmark in cell/particle counting stems from the extraordinary precision and accuracy of its particle sizing and counts, particularly as compared to manual and imaging based technologies (accuracies on the order of 98% for Coulter counters versus 75-80% for manual and vision-based systems). This can be attributed to the fact that, unlike imaging-based approaches to cell counting, the Coulter Technique makes a true three-dimensional (3-D) measurement of cells/particles which dramatically reduces count interference from debris and clustering by calculating precise volumetric information about the cells/particles. Overall this provides a means for enumerating and sizing cells in a more accurate, less tedious, less time-consuming, and less subjective means than other counting techniques6.
Despite the prominence of the Coulter technique in cell counting, its widespread use in routine biological studies has been prohibitive due to the cost and size of traditional instruments. Although a less expensive Coulter-based instrument has been produced, it has limitations as compared to its more expensive counterparts in the correction for “coincidence events” in which two or more cells pass through the aperture and are measured simultaneously. Another limitation with existing Coulter technologies is the lack of metrics on the overall health of cell samples. Consequently, additional techniques must often be used in conjunction with Coulter counting to assess cell viability. This extends experimental setup time and cost since the traditional methods of viability assessment require cell staining and/or use of expensive and cumbersome equipment such as a flow cytometer.
The Moxi Z mini automated cell counter, described here, is an ultra-small benchtop instrument that combines the accuracy of the Coulter Principle with a thin-film sensor technology to enable precise sizing and counting of particles ranging from 3-25 microns, depending on the cell counting cassette used. The M type cassette can be used to count particles from with average diameters of 4 – 25 microns (dynamic range 2 – 34 microns), and the Type S cassette can be used to count particles with and average diameter of 3 – 20 microns (dynamic range 2 – 26 microns). Since the system uses a volumetric measurement method, the 4-25 microns corresponds to a cell volume range of 34 – 8,180 fL and the 3 – 20 microns corresponds to a cell volume range of 14 – 4200 fL, which is relevant when non-spherical particles are being measured. To perform mammalian cell counts using the Moxi Z, the cells to be counted are first diluted with ORFLO or similar diluent. A cell counting cassette is inserted into the instrument, and the sample is loaded into the port of the cassette. Thousands of cells are pulled, single-file through a “Cell Sensing Zone” (CSZ) in the thin-film membrane over 8-15 seconds. Following the run, the instrument uses proprietary curve-fitting in conjunction with a proprietary software algorithm to provide coincidence event correction along with an assessment of overall culture health by determining the ratio of the number of cells in the population of interest to the total number of particles. The total particle counts include shrunken and broken down dead cells, as well as other debris and contaminants. The results are presented in histogram format with an automatic curve fit, with gates that can be adjusted manually as needed.
Ultimately, the Moxi Z enables counting with a precision and accuracy comparable to a Coulter Z2, the current gold standard, while providing additional culture health information. Furthermore it achieves these results in less time, with a smaller footprint, with significantly easier operation and maintenance, and at a fraction of the cost of comparable technologies.
Protocol
Discussion
La mise en œuvre de l'approche sous-jacente Coulter peut être très déterministe de la précision globale des mesures. Une zone critique est la correction des numérations cellulaires premières pour «coïncidence» des événements où deux ou plusieurs cellules en même temps passer à travers l'ouverture et sont évalués comme un seul événement électrique. «Les événements de coïncidence" contribuer à l'erreur qui varie en fonction d'un certain nombre de facteurs, y compris la taille des cellules et le degré de regroupement (Davis et al 1967) 6. En conséquence, la correction de coïncidence requise pour un échantillon donné ne peut être prédit, variant considérablement entre les cellules / particules types et même entre les différentes cultures de types de cellules identiques. Créée théorie, ancrée dans les publications initiales par Coulter, consiste à appliquer un ajustement logarithmique des données brutes sur la base du nombre d'événements observés et empiriquement déterminée, le facteur de correction de particules spécifique, z. Bien que des chiffres exacts peuvent être correctement réalisé avec tson algorithme de correction, il est limité dans son application pratique en raison des grandes variations de valeurs de z entre les types de cellules et de la difficulté de prévoir avec exactitude correspondant à sa valeur. Ici, en utilisant le nombre "vrai" cellule identifiée par le raccord Moxi courbe Z en conjonction avec l'algorithme de correction de coïncidence, le Z Moxi corrige de façon dynamique pour une coïncidence pour obtenir les concentrations réelles. Lorsque comparés aux résultats obtenus à l'aide de haut de gamme Coulter Z2, Z Moxi produit compte comparables à travers une gamme de concentration de 0 à 500.000 cellules / ml (de type M cassette) et 3000 – 2-2.5e 6 cellules / ml (cassette de type S) . En outre, le Z Moxi atteint cette précision de comptage avec un coefficient similaire faible variation dans le nombre et la précision dans granulométrie qui est caractéristique de l'étalon-or, Coulter-technique dans le comptage des cellules.
En outre, les données présentées ici indiquent que le Z Moxi peut fournir de précieuses informationsen ce qui concerne la santé globale des cultures cellulaires. Le Z Moxi s'appuie sur l'approche d'ajustement de courbe avec un algorithme de logiciel propriétaire pour déterminer ce bilan de santé de la culture. Les modifications morphologiques associées à la mort cellulaire, tels que blebbing, se décomposer, et les distorsions volumétriques (Kataoka et Tsuruo 1996, Liegler et al 1995, Sheridan et al 1981) 12-14, permettent à l'Moxi-Z à distinguer les différences entre les impédimétriques vivent les populations et les morts cellulaires / débris des populations. Le MVI est généré par l'analyse de la distribution de la taille de la culture / particules pour identifier les contributions relatives des débris de particules, rétrécis cellules nécrotiques, et la courbe ajustée-population de cellules d'intérêt. La valeur MVI reflète donc un indice de population ou d'une mesure ratiométrique des chiffres de population monodisperses en ce qui concerne le profil de la population globale des particules. Cette valeur est alors algorithmiquement-ajustées des statistiques basées sur la population et des observations empiriques. Because de la MVI regarde d'autres paramètres que les approches traditionnelles de coloration, on ne s'attend pas à refléter ces techniques, mais fournit plutôt un autre point de vue précieux sur la santé d'une culture cellulaire, en particulier en ce qui concerne les débris et les contaminants microbiens.
En résumé, le compteur de cellules Moxi-Z est un instrument de paillasse ultra léger qui fournit des analyses précises, reproductibles de comptage des cellules, la taille des cellules, et la santé des cellules en utilisant le principe de Coulter et des algorithmes logiciels d'ajustement de courbe combinée avec une technologie de capteur à couche mince brevetée . Avec la cassette de type M, il est capable de compter des particules allant de 4 à 25 microns de diamètre (plage dynamique de 2 – 34 microns), en 8 secondes. Avec cassette du type S, il est capable de compter des particules allant de 3 à 20 microns de diamètre (plage dynamique de 2 – 26 microns), en 15 secondes. En outre, le Moxi-Z effectue des évaluations de santé, sans l'utilisation de réactifs. C'est intégration du travail beaucoup moinsnsive et subjective que le comptage manuel. En comparaison à la norme Coulter comptage, le Moxi est plus rapide, beaucoup plus petite, fournit de plus amples renseignements, nécessite un entretien beaucoup moins, c'est plus facile à utiliser, et est une fraction du coût.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| ORFLO Diluent | ORFLO | MXA006 | |
| Cassette Dispenser | ORFLO | Stores up to 25 cassettes for convenient dispensing | |
| USB Cable | ORFLO | Connects instrument to PC/Mac or power adapter | |
| Power Adapter (US and EU models only) | ORFLO | Connects USB cable to an AC outlet | |
| USB Flash Drive | ORFLO | Stores Moxi Z software and user manual | |
| Calibration Check Beads | ORFLO | ||
| Electronic Calibration Cassette | ORFLO | Electronic cassette for verifying proper system operation and calibration |
References
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