Bestemmelse af pattedyr celletal, celler og deres størrelse sundhedstilstand ved hjælp af Moxi Z Mini automatiseret celletæller

1. Fremstillinq af prøver Fortyndes cellesuspensionen med ORFLO fortyndingsmiddel eller en egnet fortyndingsmiddel, således at cellekoncentrationen er inden for rækkevidde af instrumentet (3000 til 500.000 celler / ml for type M-kassetten, eller 3.000 til 2.500.000 celler / ml for type S kassette). En fortynding på 1:5 til 1:20 (type M-kassette) eller ingen fortynding 1:05 fortynding (type S-kassette) anbefales for de fleste mammale cellelinier, men den passende fortynding, vil afhænge af celletypen og podningstæthed. Det volumen, der kræves for at en nøjagtig optælling er ca 75 uL. 2. Running Prøver Drej Moxi Z ved at trykke på afbryderknappen og startskærmen vises. Tryk på bakken ned og indsætte en kassette i Moxi Z. afpipetteres 75μL Sample … skærmen vil blive vist. Afpipetteres en 75 pi prøve i fyldeporten af ​​kassetten (blå ovalmærket 1 eller 2, afhængigt af, hvilken ende af kassetten blev indsat i instrumentet). Disse er engangs kassetter, som kan anvendes for 2 afprøvninger. Bemærk: Anbring pipettespidsen direkte til belastningen godt ved ~ 45 ° vinkel, så at spidsen er fanget under den forreste læbe af brønden. Ved afgivelse, er det vigtigt, at vakuumet ikke "komme foran" af afgivelse af fluidet, som kan forårsage lommer af luft ind i kassetten. Det anbefales at have en lille kugle (størrelse ind brønd) i flydende form i brønden under dispensering. For at tælle de fleste mammale celler, trykke på skærmen sted at starte. Til tælling meget små partikler (4 til 8 um gennemsnitlig diameter for type M og 3-8 um gennemsnitlig diameter for Type S) kan Moxi Z drives i Small Particle tilstand. Bemærk: kasettetypen er angivet i den sorte øverst på skærmen. I denne tilstand, sætter Moxi Z diameteren skalaen til 2 til 10 um som standard og udfører tæller usynge optimerede parametre til påvisning af små celler. Tryk på TOUCH HER lille partikel Mode-knappen (sort firkant) at indlede testen og køre i denne tilstand. Den Moxi Z vil begynde testen og celletallet resultaterne vil være komplet i ca 8 sekunder (type M kassette) eller 15 sekunder (Type S kassette). Den kurvetilpasning og MVI beregninger starter automatisk og kræver kun et par ekstra sekunder. Når en passende tilpasning er fundet, vil resultaterne derefter automatisk blive vist på skærmen. For at gøre Indløbs standard købet skal du trykke på kurvetilpasningen Count knappen for at skifte til Indløbs mode. På dette tidspunkt kassetten kan fjernes fra apparatet. 3. Håndtering af data Hvis auto skalering er slukket, er resultaterne i første omgang vises i en kurvetilpasning regne med en diameter skala fra 2-34 um (Type M kassette) eller 2-26 μm (type S-kassette). Hvis auto skalering er aktiveret, så Moxi Z automatisk skalere den vandrette akse (x-akse) for det område, der er tættest på bredden af den kurve-tilpasning populationen samtidig alle kurve-fit data vises. Hvis auto skalering er slukket, manuelt at vise resultaterne i en højere opløsning, skal du trykke på 2-26 um ikonet (Type M) eller 2-18 um ikonet (type S). Bemærk: kasettetypen er angivet i den blå boks øverst til venstre på skærmen. Dette anbefales, når tæller mindre celler eller partikler for at forbedre både kurve-tilpassede funktioner samt brugerens evne til visuelt at skelne nuancer af data. Ved at øge den horisontale opløsning, vil skaleringen knappen dynamisk tilpasser sig mulighed for at cykle mellem de tilgængelige x-aksens skala intervaller: 2-34 og 2-26 og 2-18 og 2-10 um for Type M kassette eller 2 -26, 2-18, og 2-10 um for Type S kassetten. Denne funktion er kun availawas umiddelbart efter en celletælling. Tæl information (celler / ml) for kurven-fit eller gated region vises i en sort boks under den venstre side af histogrammet. Betyder cellestørrelse information vises i den sorte kasse i højre side af histogrammet. Den MVI værdi vises en blå boks øverst til højre i histogrammet. Hvis testen blev kørt i små partikler tilstand, betyder MVI ikke anvendelse, og vil blive vist som "MVI = SPM". Derudover hvis koncentrationen af ​​celler er uden for MVI driftsområde, et budskab om "MVI = Out of Range" vil blive vist. For at gemme den aktuelle histogrammet, røre Udført ikonet. Denne gemmer data med et navn "Test XXX" hvor XXX er den tilsvarende test nummer. Hvis du manuelt gate histogrammet, for at slå Curve Fit tæller resultater knap røre. Dette gør Indløbs standard dataopsamling. Skub derefter hvert blå gating markør for at indstille portene eller tryk the venstre og højre pile (disse vises ved at røre den blå gating markør) for fine gate reguleringer kun de celler, mellem markørerne tælles. Histogrammet vertikal skala skaleres automatisk baseret på kurven-fit population amplitude. For at justere denne lodrette skala, skubbe skærmen op eller ned i histogrammet regionen. Tryk på Gated Count resultater knappen for at vende tilbage til skærmbilledet kurvetilpasningen tilstand og gøre kurvetilpasning tilstand standard dataopsamling. Tryk derefter på Udført ikonet for at gemme resultaterne og vende tilbage til startskærmen. Hvis du vil slette resultaterne, skal du trykke på Delete-ikonet til enhver tid for permanent at slette resultaterne af testen. 4. Analyse af tidligere indsamlede data For at åbne en gemt test, skal du trykke på Histogram ikonet på startskærmen. Ikoner for op til ni gemte histogrammerne vil blive vist på skærmen.Tryk på ikonet for testen af interesse, eller tryk på Page Up eller Page Down ikoner for at se flere testresultater. Hvert histogram vil blive åbnet i enten Curve Fit Count tilstand eller Gated Grev tilstand, afhængigt af hvordan det blev gemt. I Gated Grev tilstand, kan gating markører placeres som ønsket ved at skubbe den enkelte blå gating mærke uafhængigt af hinanden. Auto Gate ved at trykke på den ønskede peak. Tryk for at skifte mellem Gated Greven og kurvetilpasning Måletilstande. Tryk på Zoom og Unzoom ikoner til at justere den lodrette skala i histogrammet. Den vertikale skala kan også ændres ved vertikalt at føre en finger på displayet op (for at øge) eller nedad (for at formindske). Tryk på ikonet Slet for permanent at slette resultaterne af testen. Tryk på Udført ikonet for atlukke testresultater og vende tilbage til startskærmen. (Bemærk: zoomet billede vil ikke blive gemt.) 5. Overførsel af data til en pc Data kan overføres til en pc ved hjælp af Orflo Moxichart ansøgningen eller via USB-overførsel ved at sætte Moxi Z USB-kabel til en PC eller Mac. For Bluetooth overførsel (MoxiChart), først bestemme enhedens Bluetooth-ID ved at trykke på Bluetooth-ikonet på startskærmen af Moxi Z enheden. På computeren, skal du åbne MoxiChart programmet og klik på Bluetooth-ikonet i øverste højre hjørne. Derefter vælge den enhed, der svarer til Bluetooth-id Moxi Z og vælge en destinationsmappe for de uploadede filer. Moxichart automatisk overføre alle filerne til den angivne mappe via Bluetooth-forbindelsen. Filer, der overføres via Bluetooth (MoxiChart) eller USB, kan åbnes og analyserZed direkte med MoxiChart ansøgningen, eller fordi de er formateret. csv-filer, kan de direkte åbnes i Microsoft Excel eller andre dataanalyse programmer for yderligere / custom analyse. 6. Repræsentative resultater For at vurdere præcision og nøjagtighed af Moxi Z, tællinger af HEK-293, HeLa-celler, CHO-K1, gær, Jurkat E6-1 celler, PC12 celler og præcisions-kalibreret perle suspensioner med koncentrationer fra 0-500,000 celler / ml (type M-kassette) og 0-2-2.5E 6 celler / ml (type S-kassette) blev talt og sammenlignet med en Coulter Z2 og Moxi Z. Alle pattedyrceller blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrket som tidligere beskrevet 7-11. Kort fortalt blev celler dyrket i suspension i 75 mm 2 vævskulturkolber med kerne medier i RPMI 1640 (Jurkat E6-1, PC12), MEM (HEK-293, HeLa-celler) eller F12K (CHO-K1-celler). Alle medier blev suppleret med10% føtalt bovint serum og 100 U penicillin/100 ug streptomycin. Kolberne blev holdt i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO2. Cellerne blev passeret hver 3. dag. Gærceller (X5, C. albicans, Vin 13) blev doneret og anvendt straks som angivet. Oprindelige stikprøve koncentrationer på ~ 500.000 celler / ml for de Type M kassette data og ~ 2-2.5e 6 celler / ml for Type S kassetten blev etableret ved brug af Coulter Z2. Efterfølgende teoretiske koncentrationsniveauer blev fremstillet ved serielle fortyndinger med fysiologiske puffere (Isoton II eller Hanks Balanced Salt Solution). Ved hver koncentration, blev identiske prøver målt ved begge systemer og plottet mod hinanden. Som det ses i figur 2, var der en stærk lineær korrelation (Type M r2> 0,9886, type S r2> 0,9781) mellem tællingerne for alle prøver. Koncentrationer blev også sammenlignet med de forventede / teoretisk cellekoncentrationer med både Moxi Z og Z2 ( <strong> figur 3) og igen viste kraftig lineære korrelationer (Type M r2> 0,9758, type S r2> 0,9774). At vurdere præcision blev HEK-293-og HeLa-celletal udført under anvendelse af Coulter Z2, Moxi Z og et hæmocytometer. Den gennemsnitlige variationskoefficient (CV, n = 19) af celletællinger ved hjælp af Moxi Z (type M-kassette), Coulter Z2 og et hæmocytometer blev beregnet med CV er målt fra 5 separate tællinger i 200.000-300.000 celler / ml området. Den lille gennemsnitlige CV (Figur 4) i Moxi Z er sammenlignelig med Z2 og er repræsentativ for den høje grad af præcision, kun kan opnås med Coulter-baserede tælle teknologier. Dimensionering præcision Moxi Z instrument blev evalueret ud gennem måling af indkøbte, præcision kalibrerede polystyrenkugler. Midlede partikelstørrelsesmålinger (n = 5) fra Moxi Z er plottet mod producentens rapporteret størrelser. Som det kan ses in Figur 5 er Moxi Z målingerne konsekvent matchede producentens med en høj lineær korrelation (r 2 = 0,9989). Ud over størrelse og antal oplysninger, giver Moxi Z et reagens-fri, generel vurdering af pattedyrcellekultur sundhed med en rapporteret Moxi Levedygtighed Index (MVI) værdi. Dette indeks genereres fra et forhold mellem antallet af celler i populationen af ​​interesse med hensyn til de samlede partikelformige tællinger. For at demonstrere de MVI målekapaciteten, blev MVI aflæsninger (Type M kassette) sammenlignet med standard manuel og flowcytometriske levende / død måleteknikker. Populationer af døde (<10% levedygtige) HEK-293-og HeLa-celler blev skabt ved natten inkubationer af de levende celler i en næringsstof-fri, natriumfluorid indeholdende fortyndingsmiddel (Isoton II, Beckman Coulter) ved 37 ° C. Kontrollerede teoretiske levedygtighed niveauer blev fremstillet ved ratiometrically blande kendte koncentrationer af levende og døde celler. Resulting løsninger blev analyseret for rentabilitet niveauer i to eksemplarer med både hæmocytometer tæller og flowcytometer målinger. Hæmocytometer målinger blev foretaget under anvendelse af en traditionel 50/50 blanding af 0,1% Trypan Blue Solution og celler. Flow-cytometriske målinger blev foretaget under anvendelse af en Guava PCA-cytometer (Merck) ved anvendelse af Viacount reagens og fabrikanten-specificeret protokol (Merck). Som vist i figur 6, er Pearson korrelation koefficientværdierne (R2) "af den lineære tilpasning af MVI data til analoge hæmocytometer levedygtighed procentdele for" HEK-celler og HeLa-celler blev r2 = 0,9937 og R2 = 0,9728, henholdsvis. Disse resultater viser, at denne fremgangsmåde giver kultur sundhedsinformationer tværs af en bred vifte af celler levedygtighed, som tåler sammenligning med Live / Dead målinger opnået under anvendelse af en flow-cytometer og hæmocytometer. Tabeller og Tal (Fra Dittami et al, 2011.) 15: <p class= "Jove_content"> Figur 1. Tyndfilms Coulter-tælning: Elektrisk strøm ledes gennem cellen følezonen i tynd-film kassette. Som celler flyde gåsegang gennem CSZ, er de momentane stigninger i spænding målt ved Moxi Z. Figur 2. Moxi Z tæller er sammenlignelige med Coulter Z2 tællinger. Identiske tællinger af celle-og vulsten suspensioner blev talt under anvendelse af både en Coulter Z2 og Moxi Z. gennemsnit af tælleværdier (n = 3-4) af Moxi Z tællinger blev afbildet i forhold til Coulter tilsvarende Z2 tæller og R2 værdier lineære fit blev bestemt. A) Type M kassette – koncentrationsområde på 0 – 500.000 celler / ml. B) Type S kassette – koncentrationsområde på 0 – 2-2.5e 6 / ml.Error Barer angiver ± 1 standardafvigelse. <p class="jove_content"> Figur 3. Moxi Z koncentrationsmålinger kontra teoretiske celle koncentrationer. A) Type M kassette – teoretiske koncentrationsværdier blev fremstillet ud fra seriefortyndinger af et indledende 500.000 celler / ml prøve B) Type S kassette -. Teoretiske koncentration værdier blev fremstillet ud fra seriefortyndinger af en initial 2 – 2.5E 6 celler / ml prøve. Fejllinjer angiver ± 1 standardafvigelse. Figur 4. Variationskoefficient for den Coulter Z2, Moxi Z (Type M kassette), og hæmocytometer. Den gennemsnitlige variationskoefficient (CV, n = 19) af HEK-293 og HeLa celletal for hver tilgang blev beregnet med CV'er målt fra 5 separate tællinger af HEK-293-og HeLa-celler i 200.000 – 300.000 celler / ml området. Fejllinjer angiver ± 1 standardafvigelse. <p class = "jove_content"> Figur 5. Præcision af partikelstørrelse målinger ved hjælp af Moxi Z-Moxi Z målt perle størrelse (Type M kassette) vs producent rapporteret perle størrelse. Fejllinjer angiver ± 1 standardafvigelse. Figur 6. Kultur Sundhedsvurdering hjælp MVI – Sammenligning af MVI målinger (Type M kassette) og Guava PCA Viacount levedygtighed versus visuelle, Trypan-blå farvede levedygtighedstællinger ved hjælp af en hæmocytometer.