מדידה של פעילות פקטור V בפלזמה אנושית באמצעות Assay קרישת Microplate
Summary
מחקר זה מתאר assay microplate רומן שמודד את פעילות קרישת FV במהלך היווצרות קריש פיברין בפלזמה אנושית שלא דווח בעבר. השיטה משתמשת בקורא microplate הקינטית ברציפות כדי למדוד את השינוי בספיגה ב405nm במהלך היווצרות קריש פיברין בפלזמה אנושית.
Abstract
בתגובה לפציעה, קרישת דם מופעלת ותוצאות בדור של פרוטאז הקרישה, טרומבין. פיברינוגן תרומבין דבק בפיברין אשר מהווה מסיס קריש שעוצר את הדימום. פקטור V (ע"ע) בצורתו הפעילה, FVa, הוא קריטי לcofactor פרוטאז FXa והמאיץ של דור תרומבין במהלך היווצרות קריש הפיברין כחלק מ1 prothrombinase, 2. מבחני FV הידניים תוארו 3, 4, אבל הם גוזלים זמן וסובייקטיבי. מבחנים אוטומטיים FV דווחו 5-7, אך המנתח וריאגנטים יקרים ומספקים בדרך כלל רק זמן הקריש, לא שיעור וההיקף של היווצרות פיברין. פלטפורמת microplate עדיפה למדידת אירועי אנזימים catalyzed בגלל הנוחות, זמן, עלות, נפח קטן, ניטור רציף, ותפוקה גבוהה 8, 9. מבחני microplate דווחו לתמוגה קריש 10, טסיות דם11, וגורמי קרישה 12, אך לא עבור פעילות FV בפלזמה אנושית. מטרת השיטה הייתה לפתח assay microplate שמודד את פעילות FV במהלך היווצרות פיברין בפלזמה אנושית.
שיטת microplate רומן זה מתארת assay פשוט, זול ומהיר של פעילות FV בפלזמה אנושית. Assay מנצל קורא microplate הקינטית ללפקח שינוי בספיגת 405nm במהלך היווצרות פיברין בפלזמה אנושית (איור 1) 13. הבדיקה מדויקת מודדת את הזמן, שיעור ראשוני, ומידה של היווצרות קריש פיברין. זה דורש רק כמויות μl של פלזמה, הושלם ב6 דקות, יש תפוקה גבוהה, הוא רגיש ל24 80pM FV, ומודד את הכמות הופעל שלא במתכוון (פעילות 1-במה) ו( ע"ע פעילות תרומבין הופעל-2-שלב ) כדי לקבל הערכה מלאה של הפעילות הפונקציונלית הכוללת שלה (פעילות 2-במה – פעילות 1-שלב).
intravas הופץcular הקרישה (DIC) היא coagulopathy רכש כי לרוב מתפתח מזיהומים קיימים מראש 14. דסק"ש קשור לפרוגנוזה גרועה ותמותת עליות מעל 15 פתולוגיה קיימת מראש. הבדיקה נעשתה שימוש כדי להראות כי ב9 חולים עם דסק"ש, ע.נ. 1-הבמה, 2-במה, וכלל פעילויות שירד, בממוצע, ב 54%, 44%, ו 42%, בהתאמה, בהשוואה לאדם רגיל נקווה התייחסות הפלזמה (NHP).
Assay microplate FV הוא להתאמה בקלות למדוד את הפעילות של כל גורם קרישה. assay זה יגביר את ההבנה של FV הביוכימיה שלנו באמצעות מדידה מדויקת ומלאה יותר של פעילותה במחקר ובמסגרות קליניות. מידע זה יהיה השפעה חיובית סביבות בריאות באמצעות אבחון ופיתוח טיפולים יעילים יותר להפרעות קרישה, כגון דסק"ש קודם לכן.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטת בדיקת microplate הקינטית מתארת את התפתחות רומן, טכניקה מהירה, זולה, ונוחה למדידת פעילות קרישת FV בדגימות של פלזמה אנושית אשר לא (1-assay שלב ע"ע) או שהופעל במכוון במוסף תרומבין (ע"ע 2-שלב בדיקה). Assay מנצל קורא microplate הקינטית ואת כל החומרים וריאגנטים נדרשים זמינים מסחרי או עשויים להיות בבית. בדיקת רציפות מנטרת את השינוי בפיזור האור של פלזמה במהלך היווצרות קריש פיברין ב405nm. Assay microplate יש את היתרון של שימוש בכרכי מדגם פלזמה קטנים (μl) והוא נוח לניתוח של דגימות מרובות בו זמנית (עד 12). תכונות אלו assay הן יתרון כאשר ציוד וריאגנטים יקרים משמשים (מנתחים אוטומטיים ופלזמות Factor-לקויות); רק בנפחי מדגם קטנים זמינים (פלזמות חולות) או לנתח מספר גדול של דגימות (f במהלך טיהור FVrom פלזמה).
Assay microplate FV יש את היתרונות המוספים שהוא נוח, מהיר ואינו דורש בידוד והטיהור של רכיבים המרכיבים את הנדרשים. לעומת Tilt-צינור ידני 3, 4 ו מבחני FV 5-7 אוטומטיים שכבר דיווחו, assay microplate FV יש טווח דומה שימושי של פעמי קריש (25-75 שניות) ורמות FV מקבילים במדגם (0.5-0.005 יחידות / מ"ל), ורגישות / גילוי מגבלות (20-80pM). בהשוואה למבחנים ידניים Tilt-tube ע.נ. הסובלים מהערכה חזותית הסובייקטיבי של היווצרות קריש דם 3, 4, assay microplate FV מאפשר מדידה אובייקטיבית וכמותית של זמן הקריש, שיעור ראשוני, ומידה של היווצרות קריש פיברין. בהשוואה למבחנים אוטומטיים ע.נ. הסובלים מהדרישה של מנתחים ומגיב יקרים 5-7 את ריאגנטים FV microplate assay וחומרים הם זולים ואת כל החומרים הדרושים עשויים להיות purchased מסחרי או שנעשה בבית. Tilt-צינור 3 ידניים, 4 ומבחני FV 5-7 אוטומטיים בדרך כלל רק לספק הזמן להיווצרות קריש דם, לא זמן, שיעור ראשוני, והמידה של היווצרות קריש הפיברין אשר כל למדוד במדויק spectrophotometrically עם assay microplate FV. לבסוף, מבחני FV 5-7 Tilt-צינור ידניים ואוטומטיים 3,4 סובלים מלהיות יחיד מסוגל למדוד את פעילות FV בדגימות פלזמה אחד בכל פעם, ואילו assay microplate FV הוא נוח לתפוקה גבוהה ו12 דגימות עשויות להיות assayed בו זמנית.
Assay microplate שמש כדי להוכיח שע"ע ב9 פלזמות מטופל DIC היה פחות פעיל מאשר בNHP בגלל שילוב של זמני קריש מתעכבים ושיעורים ראשוניים נמוכים יותר של היווצרות קריש דם בבדיקת ע.נ. 1-הבמה. השיעורים הראשונים של היווצרות קריש דם בבדיקת 2-שלב FV בפלזמות מטופל DIC לא השתנו מNHP. את גודל היווצרות קריש דם בדסק"ש patienלא פלזמות גם לא שונו מNHP בע.נ. 1-הבמה ומבחנים 2-במה. ירידת ע.נ. 1-במה, 2 שלבים, וכלל פעילויות הייתה אולי כתוצאה מצריכה המוגברת FV 19 ו / או איון 6 בהתאם למחקרים אחרים בפתוגנזה של מחלת דם שנרכש זה. בהתחשב בהיקף היווצרות קריש דם בפלזמות DIC היה זהה נצפה עם NHP, משתנה זה היה ככל הנראה תוצאה של ריכוז פיברינוגן בפלזמת FV-הלקויה ואינה קשור למאפיינים של פלזמות המטופל.
התוצאות של בדיקת microplate ציינו כי מדידה של פעילות FV בדגימות של פלזמה האנושית ניתן לקבל מהרגע ראשון וקצב היווצרות קריש מassay ע.נ. 1-השלב והזמן של היווצרות קריש דם ופעילות הכוללת מע.נ. 2 – assay במה. לא ניתן היה להשיג מדידת כמותית של פעילות FV בדגימת פלזמה המבוססת על המידה להיווצרות קרישים בtהוא 1 ע.נ. – ומבחנים 2-במה או השיעור הראשוני של היווצרות קריש דם בבדיקת 2-שלב FV. בהינתן כל התגובות הגיעו לאותה המידה של היווצרות קריש דם של 0.35 כ – 0.45 יחידות בין הספיגה הראשונית לפני ואחרי הספיגה המקסימלי thromboplastin ובנוסף סידן כלוריד, מדידה של היקף היווצרות קריש דם אינה מספקת הערכה כמותית של פעילות FV ב נתן דגימת פלזמה.
Assay microplate הרומן ימצא שימוש במחקר ובמסגרות קליניות למדידה של פעילות FV בדגימות של פלזמה אנושית ושברים במהלך טיהורו מפלזמה אנושית ובעלי חיים. Assay microplate עשוי לשמש למדידת הזמן, שיעור ראשוני, והיקף של היווצרות קריש דם; פרמטרים לא נבדקו כלל במקביל במבחני Tilt-tube ומנתחי קרישה אוטומטיים ידניים. מידע זה מספק יותר מהערכה כמותית שלמה של המעורבות של FV במהלך אירוע היווצרות קריש הדםבפלזמה אנושית יותר ממה שדווח בעבר 3-7. מידע זה חשוב במיוחד במחקר והן במעבדות קליניות בעת מדידת שינויים משמעותיים בפעילות FV בדגימות של פלזמה או עם מטוהר FV או FVa. Assay microplate FV עשוי לשמש גם כדי לאפיין ולמדוד תרכובות שיכולים להפעיל או לנטרל FV וFVa, למדוד את פעילות FV בחולים בסיכון לפקקת ורידים כתוצאה ממוטצית ליידן FV 20, 21 וכדי לפקח על הפעילות של FV במהלך טיהורו מהפלזמה.
Assay microplate FV הוא להתאמה בקלות למדוד את הפעילות של כל גורם קרישה במסלול החיצוני, הפנימי, או משותף באמצעות הפלזמה המתאימה גורם הלקויה וייזום ריאגנטים להיווצרות פיברין. Assay יגדיל את ההבנה של FV הביוכימיה שלנו באמצעות מדידה מדויקת ומלאה יותר של פעילותה במחקר ובמעבדות קליניות. סופיly, מידע זה יהיה השפעה חיובית סביבות בריאות באמצעות אבחון ופיתוח טיפולים יעילים יותר עבור אנשים הסובלים מהפרעות קרישה, כגון דסק"ש קודם לכן.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר נתמך בפיתוח מקצועי וקרני מחקר אתחול מאוניברסיטת אונטריו המכון טכנולוגי (UOIT) לד"ר ג'ון א Samis ומכון קנדי לפרס בריאות מחקר בריאות מקצועית לתלמיד מחקר של אירינה לויט. המחברים מודים שינון אוורט (הוראה ומרכז למידה, UOIT) על סיועה בהכנת הסרטון. המחברים מודים ד"ר מייקל א 'Nesheim (מחלקה לביוכימיה, אוניברסיטת קווינס, קינגסטון, ON) לחונכותיו, תובנה ודיונים מועילים. המחברים גם להודות ד"ר צ'נג למשכן טווה (Haemostasis רואלד דאל ומרכז פקק, רויאל ליברפול חולים האוניברסיטאי, ליברפול, אנגליה) למתן פלזמות מטופל DIC השתמש במחקר.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments (Optional) |
| Kinetic microplate reader | Molecular Devices | Spectra Max 190 | SOFTmax PRO 4.3 LS software |
| Normal pooled human reference plasma | Precision Biologicals | CCN-10 | |
| Trisodium citrate | Becton Dickenson | B10242 | |
| EDTA | Becton Dickenson | B10093 | |
| FV-deficient human plasma4 | Made from fresh human plasma and stored in aliquots at -70 °C. | ||
| 3 and 60 ml syringes | Becton Dickenson | 309585 and 136898 | |
| Butterfly apparatus | Vacutainer | 367251 | 20 gauge |
| HEPES | Sigma/Aldrich | H-3375 | |
| NaCl | Fisher | BP358-212 | |
| Thromboplastin | Trinity Biotech | T1106 | Dialyzed vs. HBS, pH 7.4 and stored in aliquots at -70 °C. |
| Calcium chloride | Becton Dickenson | B10070 | |
| Human thrombin15 | From human plasma; stored at -20 °C in 50% (v/v) glycerol. | ||
| Dialysis membrane | Fisher | 21-152-6 | 6-8kDa molecular weight cutoff; 50mm x 3m. |
| Template holder and removable 8 well strips. | Nunc | 14-245-63 and 469957 | |
| ELISA washing trays | BioRad | 224-4872 | |
| 1.5 ml microfuge and 15 ml screw capped tubes. | Sarstedt | 72690 and 62554205 | |
| Multichannel pipette | Fisher | 2703630 | 8 channel model. |
References
- Orfeo, T., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Xu, H., Butenas, S., Mann, K. G. The factor V activation paradox. J. Biol. Chem. 279, 19580-19591 (2004).
- Bukys, M. A., Blum, M. A., Kim, P. Y., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Kalafatis, M. Incorporation of factor Va into prothrombinase is required for coordinated cleavage of prothrombin by factor Xa. J. Biol. Chem. 280, 27393-273401 (2005).
- Nesheim, M. E., Katzmann, J. A., Tracy, P. B., Mann, K. G. Factor V. Methods. Enzymol. 80, 249-274 (1981).
- Bloom, J. W., Nesheim, M. E., Mann, K. G. A rapid technique for the preparation of factor V deficient plasma. Thromb. Res. 15, 595-599 (1979).
- Samis, J. A., Stewart, K. A., Nesheim, M. E., Taylor, F. B. Factor V cleavage and inactivation are temporally associated with elevated elastase during experimental sepsis. J. Thromb. Haemost. 5, 2559-2561 (2007).
- Samis, J. A., Stewart, K. A., Toh, C. H., Day, A., Downey, C., Nesheim, M. E. Temporal changes in factors associated with neutrophil elastase and coagulation in intensive care patients with a biphasic waveform and disseminated intravascular coagulation. J. Thromb. Haemost. 2, 1535-1544 (2004).
- Cutler, J. A., Patel, R., Rangarajan, S., Tait, R. C., Mitchell, M. J. Molecular characterization of 11 novel mutations in patients with heterozygous and homozygous FV deficiency. Haemophilia. 16, 937-942 (2010).
- Ihara, M., Suzuki, T., Kobayashi, N., Goto, J., Ueda, H. Open-sandwich enzyme immunoassay for one-step noncompetitive detection of corticosteroid 11-deoxycortisol. Anal. Chem. 81, 8298-8304 (2009).
- Janke, R., Genzel, Y., Wahl, A., Reichl, U. Measurement of key metabolic enzyme activities in mammalian cells using rapid and sensitive microplate-based assays. Biotechnol. Bioeng. 107, 566-581 (2010).
- Beebe, D. P., Aronson, D. L. An automated fibrinolytic assay performed in microtiter plates. Thromb. Res. 47, 123-128 (1987).
- Frantantoni, J. C., Poindexter, B. J. Measuring platelet aggregation with microplate reader. A new technical approach to platelet aggregation studies. Am. J. Clin. Pathol. 94, 613-617 (1990).
- Pratt, C. W., Monroe, D. M. Microplate coagulation assays. Biotechniques. 13, 430-433 (1992).
- Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. Development of a microplate coagulation assay for Factor V in human plasma. Thromb. J. 9, 11-16 (2011).
- Toh, C. H., Downey, C. Back to the future: Testing in disseminated intravascular coagulation. Blood Coagul. Fibrinolysis. 16, 535-542 (2005).
- Spero, J. A., Lewis, J. H., Hasiba, U. Disseminated intravascular coagulation: Findings in 346 patients. Thromb. Haemost. 43, 28-33 (1980).
- Tracy, P. B., Eide, L. L., Bowie, E. J., Mann, K. G. Radioimmunoassay of factor V in human plasma and platelets. Blood. 60, 59-63 (1982).
- Krishnaswamy, S., Nesheim, M. E., Pryzdial, E. L. G., Mann, K. G. Assembly of prothrombinase complex. Meths. Enzymol. 222 (Part A), 261-280 (1993).
- Bajzar, L., Manuel, R., Nesheim, M. E. Purification and characterization of TAFI, a thrombin-activable fibrinolysis inhibitor. J. Biol. Chem. 270, 14477-14784 (1995).
- Mammen, E. F. Disseminated intravascular coagulation (DIC). Clin. Lab. Sci. 13, 239-2345 (2000).
- Dahlbäck, B., Carlsson, M., Svensson, P. J. Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C: prediction of a cofactor to activated protein C. PNAS. 90, 1004-108 (1993).
- Dahlbäck, B. Advances in understanding pathogenic mechanisms of thrombophilic disorders. Blood. 112, 19-27 (2008).
