测量人体血浆中的凝血因子V活性，用酶联凝固分析
Summary
本研究描述了一种新颖的微孔板法测量FV凝血活性在人血浆中的纤维蛋白凝块的形成还没有被以前的报告。该方法使用一个动能酶标仪人血浆中的纤维蛋白凝块的形成过程中，连续地测量在405nm处的吸光度变化。
Abstract
以响应于损伤，血液凝固被激活，并在产生凝血蛋白酶，凝血酶的结果。的凝血酶裂解纤维蛋白原，纤维蛋白形成不溶性凝块，停止出血。其活化形式，FVA，凝血因子V（FV）是一个重要的辅助因子的蛋白酶的FXa和加速器的凝血酶生成期间为凝血酶原酶 1，2的一部分的纤维蛋白凝块的形成。手册FV检测已被描述3，4，但它们是费时的和主观的。自动FV检测已报道5-7，但分析仪和试剂是昂贵的，一般只提供血块的时间，而不是纤维蛋白形成的速率和程度。微孔板平台优选酶催化的事件，这是因为测量的方便，时间，成本，体积小，连续监测，和高吞吐量的8，9。已报告的血块溶解，血小板聚集微孔板检测11，凝血因子12，但不适用于人体血浆中的FV活动。我们的目标的方法是开发一个微孔板检测人血浆中纤维蛋白的形成过程中，测量FV活动。
这种新颖的的微孔板方法，勾勒出简单，价格低廉，快速检测人血浆中的FV活动。该试验利用动能酶标仪在人血浆中的纤维蛋白的形成（ 图1）13 中，以监测在405nm处的吸光度变化。该检测精确测量的时间，初始速率和程度的血纤维蛋白凝块的形成。它仅需要微升量的血浆，在6分钟完成，具有高吞吐量，是敏感24-80pM FV，和测量的量无意中激活（1阶段的活性）和凝血酶活化的FV（2级活动），以获得一个完整的评估，其总的功能活性（2级活动 – 1阶段的活动）。
弥漫性intravas所辖内凝血（DIC）是一种获得性凝血功能障碍，最常见的开发从已存在的感染14。 DIC以上的预现有的病理与预后差，增加死亡率。检测显示，9例DIC，FV 1级，2级，总活动减少，平均而言，54％，44％，42％，分别比正常汇集人类参考血浆（NHP）。
FV微孔板法测量任何凝血因子的活性是很容易适应。该法将提高我们的的FV生物化学的了解，通过更准确，更完整的测量，其活动的研究和临床。这些信息将医疗环境，通过更有效的治疗凝血功能障碍，如DIC的早期诊断和发展产生积极的影响。
Protocol
1。 FV缺陷的人血浆制备此方法是最初Bloom 等人 4所描述的步骤的变形。 获取整个人类的血液同意健康的成年志愿者（男或女，年龄18 – 50岁），未服用任何药物。戴乳胶手套和实验室外套，整个手术过程。 制备100毫升的3.2％（重量/体积）的柠檬酸三钠在蒸馏水中。 6.0毫升该溶液中加载到单独的60毫升注射器。拆下空气郁闷柱塞仔细的6.0毫升的注射器上标记。 使用酒精棉球清洁区之间的二头肌和前臂，肘正中静脉。连接20号蝴蝶装置3毫升注射器。蝴蝶针插入到肘正中静脉，轻轻画上柱塞，直到血液填充到3毫升标记。放弃与血液的注射器。执行此步骤，以消除任何组织因子在针从损坏的内皮细胞释放可激活凝血过程中的损伤部位和干扰的准备FV缺陷等离子。 连接蝴蝶针60 ml注射器'加载'与6.0毫升的柠檬酸三钠和绘制轻轻地放在柱塞，直到血液到达的60毫升注射器上标记。 （决赛的柠檬酸浓度10.9毫米）。 将注射器从蝴蝶针，轻轻地混合注射器，注射器上的插座，同时保持一个戴着手套的手指或拇指。 继续抽血成60毫升注射器各填充有如上所述的6.0毫升的3.2％柠檬酸三钠。人们应该预期回收约50％的柠檬酸血液体积，离心后，需要每个样品50μl的FV-缺陷血浆中的微孔板检测血浆。我们的实验室常规处理300-420毫升血液含柠檬酸，在每次使用5-7×60毫升注射器6.0毫升3.2％柠檬酸钠/注射器。这是缺乏足够的FV-等离子约3,000微板试验（见下文）。 志愿者的手臂，然后按删除蝴蝶针静脉穿刺部位用无菌纱布垫1.0分钟。量静脉穿刺部位用无菌绷带。 在3,300 xg离心20分钟，在室温下离心柠檬酸血液。恢复黄河上游等离子层塑料烧杯中搅拌棒用塑料移液管小心不要打扰下红和白血细胞层。 测量体积的血浆毫升，保留100μL血浆前冰EDTA的添加对未来的凝血酶原的血块的时间（PT）测试（见下文）。 慢慢加入固体与温和的搅拌，在室温下实现5mM的EDTA枸橼酸血浆（终浓度）。一旦已经溶解的EDTA，pH调节到7.0，通过温和搅拌下滴加1.0M的NaOH。 量烧杯中，用保鲜膜，并培育8-10小时无搅拌，在37°C。 每2个小时，恢复100微升EDTA-处理过的血浆在冰上，并确定PT在孵化用EDTA的时间和比较血浆的PT之前到EDTA此外（见上文）。 PT测定，地方可移动的8的良好immunomodule条到塑料模板的持有人，并插入酶标仪。 在酶标仪东方immunomodule条：空，空，样品，样品，空，空，空，空由左到右的模板支架，以尽量减少光的散射干扰邻近的样品含带。此外，使用井2-7 8的好immunomodule条在每个从顶部向底部的塑料模板支架的边缘，以减少散射光的干扰。 FV微孔板检测是能测量血纤维蛋白凝块的形成，在至少12个不同的样本，同时（6超过2 immunomodule条）样本每immunomodule条。 使用多道移液器，加入50μl哈佛商学院（20MM HEPES，pH值7.4，150mM NaCl的）每个微孔板以及为每个待测定的样品。使用一个单一的吸移管中，添加50微升正常人体汇集参考血浆（NHP）或血浆加入EDTA之前或在培养不同时间后，加入EDTA至微孔板分开。 使用多道移液器，加入50μl凝血活酶（请参阅下面的制备方法）的所有微孔板与血浆进行检测。酶标仪孵育在25℃下1分钟，程序酶标仪摇动板孵育1分钟15-25秒期间。 使用酶标仪，设施SoftMax Pro软件微孔板的应用程序接口与计算机。设置读者的吸光度，波长405nm处，模式动力学，温度至25℃，和程序酶标仪动摇，持续5秒，和6分钟，在405nm处读取吸光度每5秒。 使用多道移液器，添加氯化钙（50微升25mm的蒸馏水，2.1MM国际泳联升浓度），所有的微孔板，等待15秒，，微孔板的SoftMax Pro菜单，然后按“开始”图标，开始试验。 确定点的吸光度随时间变化曲线中的SoftMax Pro的时间达到半最大增幅，在405nm处的吸光度（中点后产生的凝血活酶和氯化钙此外吸光度随时间变化曲线的S形。以下， 图1）。 计算的FV 1阶段的活动从登陆血块时间（秒）与登陆FV活性（单位/ ml），如下图所示，在图2A中。对于定量的目的被定义为，1台的FV活性的活性存在于故意激活与加入凝血酶（见下文，与FV 1阶段和2阶段微孔板凝固分析含量测定人血浆样品）前1.0毫升NHP。 温和搅拌下在蒸馏水中与含有0.15M NaCl的20mM HEPES4.0升做准备。调整pH值至7.4，缓慢dropw伊势，加入5.0M的NaOH（HBS，pH 7.4）中。 获得足够的透析管的长度，并用蒸馏水彻底冲洗。管的一端打结。转让EDTA处理血浆透析管，用塑料移液管，排除空气，并在管的另一端打结。 小心地挂在哈佛商学院的EDTA处理的等离子管，轻轻搅拌。量与保鲜膜，并在4℃下缓慢搅拌下的14 – 16小时透析小心地取出EDTA-treated/dialyzed的血浆中15.0毫升螺旋盖管，并保留“最终”冰FV缺陷等离子PT测定的100微升3.0毫升等分。的FV-缺陷血浆储存在-80℃直至使用。在上述条件下，PT的增加，从10-15秒之前EDTA此外90-100秒8-10小时后EDTA此外。由这种方法制备的FV-缺陷血浆常规包含小于0.1％的FV的活性存在于起始新鲜人血浆。 2。制备凝血活酶透析是必需的，以消除任何钙从该试剂中，以允许精确地定时从氯化钙时，除了启动凝血过程的纤维蛋白凝块的形成。 制备100毫升和4.0升的20mM HEPES，0.15M NaCl的蒸馏水中，在缓慢搅拌下在塑料烧杯中。调节pH值至7.4，用5.0M NaOH（HBS，pH值7.4）中缓慢滴加。 各瓶中加入6.0毫升，pH值7.4 HBS的凝血活酶试剂，更换盖子，轻轻摇晃溶解。孵育15分钟，在室温下干燥的材料溶解试剂封端的小瓶。轻轻振荡至完全溶解。 切一个足够长的透析管，用蒸馏水冲洗，并配合管的一端与一个结。凝血活酶转移到透析管，排除空气，并配合另一端的管道与结。 钙refully挂在哈佛商学院，pH值7.44.0升的透析管，轻轻搅拌均匀覆盖着保鲜膜在4°C为14-16小时。 3.0毫升等分试样的透析的凝血活酶转移至15毫升螺旋盖管和存储于-80℃直至使用。 3。制备FV-微孔板凝固分析活动标准曲线解冻FV-缺陷血浆，NHP，和凝血活酶在37℃下10分钟。轻轻地混合血浆和凝血活酶缺乏FV-独立，转移到塑料清洗托盘分开，并在冰上孵育。请将NHP上冰后轻轻搅拌。商店氯化钙（在蒸馏水中的25mM）在一个单独的洗涤，在室温下的托盘。 准备各200微升2倍系列稀释液，NHP从0 – ，2 – ，4 – ，8 – ，16 – ，32 – ，64 – ，128 – ，256 – ，512倍，在HBS中，pH值7.4用1.5 ml微量离心管。涡和冰上孵育。 将可移动的8个很好immunomodule条到plastic模板支架，并插入酶标仪。 在酶标仪东方immunomodule条：空，空，样品，样品，空，空，空，空由左到右的模板支架，以尽量减少光的散射干扰邻近的样品含带。此外，使用井2-7 8的好immunomodule条在每个从顶部向底部的塑料模板支架的边缘，以减少散射光的干扰。 FV微孔板检测是能测量血纤维蛋白凝块的形成，在至少12个不同的样本，同时（6超过2 immunomodule条）样本每immunomodule条。 打开酶标仪访问的SoftMax Pro微孔板应用软件。 使用多通道移液管，使FV-缺陷血浆（50微升）的同时增加到所有样本微孔板。使用一个单一的移液管中，加入50μl的10系列稀释液制备的NHP上述分离微孔板。使用多道移液器，添加促凝血酶原激酶（50微升）的所有样品井。酶标仪在在25℃下孵育1分钟，程序酶标仪在15-25秒的孵育1分钟，摇动板。 使用酶标仪，设施SoftMax Pro软件微孔板的应用程序接口与计算机。设置读者吸光度，波长405nm处，模式动力学，温度为25°C，和程序的酶标仪振摇在第5秒后添加氯化钙，并且在405nm处测量吸光度每5秒后的6分钟。 5秒的振荡间隔，不包含在所计算的凝块时间（见下文）。 使用多道移液器，添加氯化钙（50μL蒸馏水为25mm;终浓度为3.5毫米），所有样品微孔板，等待15秒，按“开始”图标，在微孔板的SoftMax Pro的应用程序从计算机开始法。 Ţ他血块倍的时间，以秒计算的促凝血酶原激酶和氯化钙的添加后，在405nm处达到的中点之间的最小和最大吸光度。 在405nm处的吸光度的增加速率（mUnits /分钟），包围第1凝块形成的5个时间点的吸光度与时间的关系曲线的线性部分计算为凝块形成的初始速度。 凝块形成的程度被计算为在405nm处（单位）的最大和最小之间的吸光度的差异的凝块形成事件期间取得。 4。分析人体血浆样本FV 1级和2级微孔板凝固分析解冻FV-缺陷血浆，NHP，样品的等离子体，并促凝血酶原激酶，在37℃下10分钟。轻轻地混合血浆和凝血活酶缺乏FV-独立，转移到单独的塑料ELISA清洗托盘，和在冰上培育。存储NHP和样品等离子体冰后轻轻搅拌。商店氯化钙（在蒸馏水中的25mM）在一个单独的ELISA洗涤，在室温下的托盘。 准备NHP和样品的等离子体在HBS中，pH为7.4，使用1.5毫升微量离心管中的40倍稀释液各200微升。涡和冰上孵育。 将可移动8的良好immunomodule条塑料模板支架插入酶标仪。 的备用空，空，样品，空，空，样品，空，空immunomodule的条由左到右的模板支架，以尽量减少光的散射干扰邻近的样品含带。只能使用2-7井从顶部底部在每个immunomodule条，以尽量减少光的散射干扰的塑料模板支架的边缘。 打开酶标仪访问的SoftMax Pro微孔板应用软件。 使用多道移液器，FV-缺陷血浆（50微升）添加到所有样本微孔板。使用SINGLË移液管中，加入50μl的40倍稀释的NHP或样品等离子体上述制备分离微孔板。 使用多道移液器，添加促凝血酶原激酶（50微升）的所有样品井。酶标仪在在25℃下孵育1分钟，程序酶标仪在15-25秒的孵育1分钟，摇动板。 使用酶标仪，设施SoftMax Pro软件微孔板的应用程序接口与计算机。设置读者吸光度，波长405nm处，模式动力学，温度为25°C，和程序的酶标仪振摇在第5秒后添加氯化钙，并且在405nm处测量吸光度每5秒后的6分钟。 5秒的振荡间隔，不包含在所计算的凝块时间（见下文）。 使用多道移液器，添加氯化钙（50微升为25mm，在蒸馏水的6.25mM最终浓度）的所有样品微孔板，并立即公关ESS的“开始”图标，在微孔板的SoftMax Pro的应用程序从计算机开始检测。 在运行结束时，确定的时间，初始从吸光率随时间的公司中的SoftMax Pro中稀释40倍的NHP和样品的等离子体的凝块形成的速率和程度。 考虑到40倍稀释，使用时间为每个样品的血块，计算FV活动的单位/ ml的FV 1阶段的活动日志血块时间与登录的FV活动（ 图2A）的标准曲线。这代表了FV-1阶段的活动，如果没有“故意”激活凝血酶。 FVA 1，与凝血酶的加法和孵化后的第二检测由于FV被激活与凝血酶的活性的辅因子，是至关重要的精确测量的FV 2级的血浆样品的活性（随着“有意添加凝血酶激活）。 FV 2阶段的试验，准备200-300μl的纯化凝血酶18一哈佛商学院，pH值7.4吨100nm的孵化冰。计划使用10微升稀释的凝血酶与FV 2级测定待测定每个血浆样品。 稀释120微升上述NHP和样品的等离子体从40倍到100倍，用170微升，pH值7.4的HBS含有2.8MM氯化钙。加入10μl的凝血酶（10nm的最终浓度），各样品。涡混合，并在37°C孵育1分钟。 NHP和样品等离子体稀释至500倍，加入400微升的HBS，pH值7.4，涡流以及，测定各血浆样品的50微升的FV 1阶段微孔板法如上所述。 确定NHP和各血浆样品测定的吸光度随时间变化曲线中的SoftMax Pro的血液凝块的时间。考虑到500倍稀释液，使用血液凝块的时间为每个样本计算FV 2阶段活动的FV 1级标准曲线的日志血块时间与登录FV活动的的（ 图2A）。 总FV活动然后可被计算为FV 2级活动 – FV 1阶段活动性。
Representative Results
代表性的成果 – 1级FV微孔板凝血试验活动的标准曲线的制备在FV随着时间的推移产生的酶标仪测定血纤维蛋白凝块形成的代表性例子在图1中示出。的FV测定精确测量的时间，初始速率和程度的血纤维蛋白凝块的形成。检查井试验完成后出现凝块的形成。所有的反应达到了血块的形成大致相同的程度，一般为0.35在405nm处的吸光度变化 – 0.45单位之间的起始吸光度之前和促凝血酶原激酶和氯化钙的除了最大后的吸光度。典型的例子FV 1级活动标准曲线的日志血块时间（以秒为单位）与登录FV活动（单位/毫升），并登录初始凝块形成速率（在mUnits /分）与登录FV活动（单位/毫升NHP系列稀释液）中示出<strong>的图2A和图2B中 ，分别拟合log-log图凝块时间与FV 1活动表明了牢固的合作关系，这些变量之间的线性回归分析（ 图2A，R 2 = 0.980）。拟合log-log图的血块形成与FV活动的的初始速度也表明了牢固的合作关系后，这些变量之间的线性回归分析（ 图2B，R 2 = 0.983）。保持线性关系的两个日志凝块时间和登录血凝块形成的初始速率与登录FV活动NHP稀释到512倍。由于FV循环NHP在约12-40nm的16，微孔板检测是敏感，约24 80pM FV NHP的。 FV微孔板法鉴于FVA-FXa的-类脂在凝血酶原酶的相互作用的解离常数是约1nm的17，是完全适合的中的FV电平的测量的生理relevan吨纳米范围内为FVA功能凝血酶原。 使用FV微孔板检测，也有人FV 1级活性测定15名健康控制等离子体（男性和女性，年龄18 – 20yrs）的FV活动中的正常范围为（平均值±标准偏差范围）： 0.96±0.14U/ml; 0.68-1.11U/ml。同意与正常健康的FV活动和的范围（0.66-1.14U/ml）Cutler 等人 。 FV 1级活动自动分析仪7。批内变异的时间，程度和血凝块形成FV 1阶段试验在不同的8天6口井的初始速度分别为3.4％，4.4％和3.1％。批间变异的时间，程度，FV 1阶段试验在8个不同的实验，不同的8天6口井的血凝块形成的初始速度分别为7.1％，7.8％和9.2％。因此，这三个measu内和批间变异红色的变量是在一个可接受水平之内和之间微孔板同时检测多个样品（最多12个）的强大的检测性能。 代表性的成果 – 分析人体血浆样本FV 1级和2级微孔板凝固分析日志血块时间与日志FV活动的标准曲线（ 图2A）是用来衡量NHP 9 DIC病人等离子体不是故意激活增值凝血酶（FV 1级活动），或故意激活FV活动加入凝血酶（FV的2级活动），其结果示于表1中。全部9 DIC病人等离子体表现出FV 1阶段的活动和血凝块形成的初始速度平均分别下降54％和18％，分别从NHP。在DIC患者FV 1阶段试验的血凝块形成的程度没有很大的不同，NHP，平均增加了13％，从NHP。 NHP与凝血酶的激活产生的近似8倍的增长，在FV的FV 1阶段的活性（表1）以上的2 – 阶段活动。这表明，在NHP的公允价值，主要是在未激活的形式存在，并同意与先前报告的结果，使用手动倾斜管FV分析3，4，自动FV分析5-7。在DIC患者的平均FV 2级和总活性也下降，由44％和42％，分别从NHP。初始在FV 2 – 阶段检测在DIC患者的凝块形成的速率以及程度，没有显着不同，NHP，平均变化，由约9％和4％，分别为，从所观察到的与NHP。这些结果表明，相对于在较长的时间内，在NHP FV，FV的DIC病人等离子体中产生的纤维蛋白凝块的形成率下降，患者FV平均而言，只有56％的激活凝血酶。 ENT“FO：保持together.within”页面=“总是”> 图1在正常混合人与动能微孔板FV 1阶段的凝固分析测得的参考血浆的血凝块形成。使用动能酶标仪在405nm的纤维蛋白凝块的形成NHP连续监测。该地块是6分钟反应的32倍稀释的NHP，FV-缺陷血浆，促凝血酶原激酶，和氯化钙的微孔板以及酶标仪输出。垂直轴表示作为一个结果，在血浆中的纤维蛋白的形成发生在405nm处的吸光度变化。血纤维蛋白形成的时间的时间到达的半最大光吸收增加，或曲线的中点（36.40秒）被定义为。最初的凝块形成速率被定义为在405nm处的吸光度的变化率在所述第一5个时间点的曲线的吸光度部（611.88 mUnits /分钟）的线性增加。这位前被定义为在405nm处（0.35单位）的最大值和最小值之间的吸光度的差异帐篷凝块形成。 图2。凝块形成对比使用的FV 1阶段微孔板法在正常汇集人参考血浆因子V活性的时间和初始速率的标准曲线。 NHP连续稀释（0 – 在HBS 512倍），在协议中所描述的FV 1阶段微孔板法测定。登陆登陆地块线性回归建模后的面板中的数据A和B，分别显示的时间和初始速度，在1阶段的FV微孔板法凝块形成对FV活性。 样品 1级测定活动（单位/ ml） 1级检测范围（单位） <td> 1阶段测定初始评估（mUnits /分钟） 2级测定活（单位/ ml） 2级检测范围（单位） 2级测定初始评估（mUnits /分钟） 总活性（单位/ ml） NHP 1.02 0.363 744.96 7.93 0.433 375.84 6.91 患者1 0.36 0.404 583.80 3.84 0.432 249.96 3.48 患者2 0.67 0.416 704.04 5.28 0.469 323.16 4.61 <strong>患者3 0.31 0.435 562.08 3.92 0.453 294.96 3.61 患者4 0.39 0.435 617.04 4.14 0.462 372.60 3.75 患者5 0.73 0.401 641.40 5.91 0.433 354.24 5.18 患者6 0.45 0.403 600.72 4.16 0.445 393.96 3.71 患者7 0.49 0.395 575.40 4.89 0.449 357.48 4.40 患者8 0.19 0.448 489.00 2.89 0.450 330.48 2.70 患者9 0.64 0.423 699.48 5.11 0.455 417.24 4.47 表1 FV活动NHP和开发弥散性血管内凝血（DIC）9例 FV 1级，2级和NHP与DIC病人等离子体9的总活性测定FV 1阶段微孔板检测标准。曲线对比FV活性（ 图2A）的凝块形成的时间，并且给定的单位/ ml。初始速度（初始速率增加A405nm前五个时间点在mUnits /分钟）和程度（最大A405nm – 最少A40为5nm）的凝块形成的FV是1 – 和2 – 阶段微孔板法中也示。
Discussion
动力学微孔板测定方法概述FV凝血活性的测量的人血浆样品中，没有（FV 1阶段测定）或一种新型的，快速，廉价，和方便的技术的发展已被有意地激活与增值凝血酶（FV 2阶段的测定）。该试验利用动能酶标仪和所有所需的原料和试剂是市售的，或者可以由在内部。该试验连续监测：在405nm处的血纤维蛋白凝块的形成过程中的等离子体中的光散射的变化。微孔板法使用小的血浆样品体积（μl）的，具有的优点是适合用于分析多个样品的同时（最多12个）。这些测定属性是有利的，当使用昂贵的设备和试剂（自动分析仪和因子缺陷等离子体）;只有小样品体积可用（病人等离子体）或分析大量的样品（在FV纯化期间from的血浆）。
FV微孔板法具有额外的优点，即它是方便，快捷，并且不需要分离和纯化所需的构成成分。的FV微孔板法具有与手动倾斜管3，4和自动化已报道的5-7 FV检测相比，比较有用的范围凝块的时间（25-75秒）和相应的FV样品中的水平（0.5-0.005单位/毫升），和灵敏度/检测限（20-80pM）。 FV微孔板法与手动倾斜管FV检测遭受从主观视觉评估凝块形成3，4的相比，允许客观和定量测量的凝块的时间，初始速率和程度的血纤维蛋白凝块的形成。与遭受的要求，昂贵的分析仪及试剂5-7的自动化的FV分析，比较，FV微孔板检测试剂和材料价格便宜，可能是选购电脑所需的所有材料sed的商业或内部。手动倾斜管3，4和自动化5-7 FV检测一般只提供凝块形成的时间;不在的时候，初始速率和程度都准确地测定分光光度法与FV微孔板法的血纤维蛋白凝块的形成。最后，手动倾斜管3,4和自动化5-7 FV检测患有唯一能测量血浆样品一次的的FV活动中;，而FV微孔板法是适合于高吞吐量和12个样品可能同时分析。
微孔板法是用来证明，在9 DIC病人等离子体的FV是较不活跃因为延迟血块的时间和较低的初始速度在FV 1阶段测定的凝块形成的组合中NHP。从NHP FV 2阶段试验在DIC病人等离子体血凝块形成的初始速度没有改变。在DIC患者年龄血凝块形成的程度吨等离子电视也没有改变NHP FV 1级和2级检测。减少FV 1级，2级，和总的活动可能是由于增加FV消费19和/或失活6按照与其他研究在此取得的血液疾病的发病机制。鉴于在DIC等离子体凝块形成的程度是相同的观察NHP，此变量是最有可能的FV-缺陷血浆中的纤维蛋白原浓度的结果，而不是相关的病人的等离子体的特性。
从微孔板检测的结果表明，FV的人血浆样品中的活性的测量可以得到从时间和初始从FV 1阶段测定凝块形成速率和凝块形成的时间和总活性从FV 2 – 阶段试验。这是不可能的，以获得定量测定血浆样品中的FV活性凝块形成的程度，在t的基础上他FV 1 – 和2 – 阶段实验或凝块形成的FV 2阶段的测定中的初始速率。鉴于所有的反应达到约相同程度的凝块形成为0.35 – 0.45单位之间的初始吸光度前和后凝血活酶的最大吸光度和氯化钙此外，测量凝块形成的程度，在不提供一个定量的评估的FV活性给定的血浆样品。
新颖的微孔板法会发现及其从人类和动物的血浆中的纯化的人类血浆和组分在样品中的FV活性的测量使用在研究和临床设置。微孔板法可用于测量的时间，初始的凝块形成的速率和程度;参数一般不同时监控在手动倾斜管检测和自动凝血分析仪。在血块形成事件信息提供了更多的参与FV一个完整的定量评估人血浆中比以前已经3-7。此信息是特别重要的，在研究和临床实验室测量时，显着变化在FV的血浆样品中的活性或与纯化的FV或FVA。 FV微孔板法也可用于表征和测量的化合物，可激活或灭活FV和FVA，静脉血栓形成的风险，测量患者的FV活性FV Leiden突变的结果为20，21，并监测的活性FV在其从血浆中提纯。
FV微孔板法是很容易适应测量外在的，内在的，或共同途径凝血因子的活性的任何使用适当的因子-缺陷血浆和发起了血纤维蛋白形成的试剂。该法将提高我们的的FV生物化学的了解，通过更准确，更完整的测量，其活动的研究和临床实验室。最终LY，此信息将产生积极影响医疗环境中，通过更有效的治疗患有凝血功能障碍，如DIC的早期诊断和发展。
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了专业发展和研究的启动资金从大学，安大略省理工大学（UOIT）博士约翰·A.萨米和加拿大卫生研究院卫生专业学生研究奖伊琳娜·莱维特。作者承认香埃弗里特（教学及学习中心，UOIT）援助，为她准备的视频。作者承认博士迈克尔E. Nesheim（生物化学系，皇后大学，金斯顿，ON）为他的师友，洞察和有益的讨论。作者也承认郑博士福卓（罗尔德·达尔止血和血栓形成的中心，英国皇家利物浦大学医院，利物浦）提供的DIC病人等离子体研究中使用的。
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments (Optional) |
| Kinetic microplate reader | Molecular Devices | Spectra Max 190 | SOFTmax PRO 4.3 LS software |
| Normal pooled human reference plasma | Precision Biologicals | CCN-10 | |
| Trisodium citrate | Becton Dickenson | B10242 | |
| EDTA | Becton Dickenson | B10093 | |
| FV-deficient human plasma4 | Made from fresh human plasma and stored in aliquots at -70 °C. | ||
| 3 and 60 ml syringes | Becton Dickenson | 309585 and 136898 | |
| Butterfly apparatus | Vacutainer | 367251 | 20 gauge |
| HEPES | Sigma/Aldrich | H-3375 | |
| NaCl | Fisher | BP358-212 | |
| Thromboplastin | Trinity Biotech | T1106 | Dialyzed vs. HBS, pH 7.4 and stored in aliquots at -70 °C. |
| Calcium chloride | Becton Dickenson | B10070 | |
| Human thrombin15 | From human plasma; stored at -20 °C in 50% (v/v) glycerol. | ||
| Dialysis membrane | Fisher | 21-152-6 | 6-8kDa molecular weight cutoff; 50mm x 3m. |
| Template holder and removable 8 well strips. | Nunc | 14-245-63 and 469957 | |
| ELISA washing trays | BioRad | 224-4872 | |
| 1.5 ml microfuge and 15 ml screw capped tubes. | Sarstedt | 72690 and 62554205 | |
| Multichannel pipette | Fisher | 2703630 | 8 channel model. |
References
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Factor V ActivityHuman PlasmaMicroplate Coagulation AssayBlood CoagulationThrombinFibrinogenClot FormationProthrombinaseFV AssaysAutomated FV AssaysMicroplate PlatformEnzyme-catalyzed EventsClot LysisPlatelet AggregationCoagulation FactorsFV Activity MeasurementKinetic Microplate ReaderAbsorbance Change At 405nm
Citer Cet Article
Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay. J. Vis. Exp. (67), e3822, doi:10.3791/3822 (2012).