Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-assoziierte Virus (AAV) Vektoren für die Gentherapie über DNA-Familie Shuffling
Summary
Wir zeigen die grundlegende Technik zur molekularen konstruieren und zu entwickeln synthetischen Adeno-assoziierte virale (AAV) Vektoren für die Gentherapie durch DNA-Shuffling Familie. Darüber hinaus bieten wir allgemeine Richtlinien und repräsentative Beispiele für die Auswahl und Analyse der einzelnen chimären Kapside mit verbesserten Eigenschaften auf Ziel-Zellen in Kultur oder in der Maus.
Abstract
Adeno-assoziierte virale (AAV) Vektoren repräsentieren einige der stärksten und viel versprechende therapeutische Fahrzeuge für die menschliche Gen-Transfer aufgrund einer einzigartigen Kombination von positiven Eigenschaften ein. Dazu gehören die Apathogenität der zugrunde liegenden Wildtyp Viren und hochentwickelte Methoden zur Herstellung von hohem Titer, hoher Reinheit und klinisch-Klasse rekombinanten Vektoren 2. Ein weiterer besonderer Vorteil des AAV-Systems gegenüber anderen Viren ist die Verfügbarkeit von einer Vielzahl von natürlich vorkommenden Serotypen, die in wesentlichen Eigenschaften unterscheiden sich noch, lassen sich bequem als Vektoren mit Hilfe eines gemeinsamen Protokolls 1,2 konstruiert werden. Darüber hinaus wurden eine Reihe von Gruppen, einschließlich unserer eigenen kürzlich Strategien, um diese natürlichen Viren als Vorlagen für die Erstellung von synthetischen Vektoren, die entweder vereinen die Vorzüge von mehreren Input-Serotypen, oder durch die der Eigenschaften eines einzelnen isolieren verwenden ausgedacht. Die entsprechenden Technologien, um diese Ziele zu erreichen are Familie entweder DNA shuffling 3, dh Fragmentierung der verschiedenen AAV-Kapsid Gene durch ihre erneute Montage auf partielle Homologien (typischerweise> 80% für die meisten AAV-Serotypen) oder Peptid-Display 4,5, dh Einfügen von in der Regel sieben Aminosäuren in der Basis gefolgt eine freiliegende Schleife des viralen Kapsids wobei das Peptid im Idealfall vermittelt wieder Ausrichtung auf einen gewünschten Zelltyp. Für maximalen Erfolg, sind beide Methoden in einem High-Throughput-Mode, wobei die Protokolle werden hochskaliert, um Bibliotheken von rund einer Million verschiedene Varianten ergeben Kapsid angewendet. Jeder Klon wird dann aus einer einzigartigen Kombination von zahlreichen elterliche Viren (DNA-Shuffling-Ansatz) umfasst oder enthält einen unverwechselbaren Peptids innerhalb der gleichen viralen Rückgrat (Peptid-Display-Ansatz). In der abschließenden Schritt ist iterativen Auswahl einer solchen Bibliothek auf Zielzellen, um für einzelne Kapside erfüllen die meisten oder am besten alle Anforderungen des Auswahlverfahrens zu bereichern. Die letztere vorzugsweise Kammines Überdruck, wie Wachstum auf einem bestimmten Zelltyp von Interesse, mit negativer Selektion, zum Beispiel Beseitigung aller Kapside Umsetzung mit Anti-AAV Antikörper. Diese Kombination erhöht die Chancen, dass synthetische Kapside überlebenden die Auswahl die Bedürfnisse der jeweiligen Anwendung, in einer Weise, die wahrscheinlich nicht in jeder beliebigen natürlich vorkommenden AAV isolieren gefunden übereinstimmen. Hier konzentrieren wir uns auf die DNA-Familie schlurfenden Methode als theoretisch und experimentell schwierigere der beiden Technologien. Wir beschreiben und zeigen alle wesentlichen Schritte für die Erzeugung und Auswahl von neu gemischt AAV-Bibliotheken (Abb. 1), und dann besprechen die Fallstricke und kritische Aspekte der Protokolle, die man braucht, um sich bewusst sein, um mit molekularen Evolution AAV erfolgreich zu sein.
Protocol
Discussion
Hier haben wir wesentliche experimentelle Schritte und Richtlinien für die AAV-Kapsid Engineering über DNA-Shuffling und Familie für die Evolution in Zellen oder Tiere dargestellt. Im Wesentlichen sind diese Protokolle standardisierte Versionen der Verfahren, die wir zunächst innerhalb der AAV-Bereich berichtet in 2008 3. Während eine Flut von Follow-up-Studien von anderen zahlreichen Modifikationen zB 10-13 berichtet haben, stellen unsere gegenwärtigen Versionen grundlegende Strateg…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken für herausragende Unterstützung ihrer Labor-, Team-Mitglieder und Arbeit des Exzellenzclusters CellNetworks an der Universität Heidelberg sowie von der Chica und Heinz Schaller (CHS) Fundament. Wir schätzen, dass die molekulare Evolution über AAV DNA shuffling Familie hat sich ein sehr aktives Gebiet seit unserer ersten Veröffentlichung vor drei Jahren und so allen Autoren einschlägiger Publikationen, deren Arbeit nicht hier aus Platzgründen zitiert werden entschuldigen.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DNase I | Invitrogen | 18068-015 |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 |
| Restriction enzymes | NEB | Various |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202T |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 |
| Phusion II polymerase Kit | Finnzymes (NEB) | F-540S |
| HotStar Hifi polymerase Kit | Qiagen | 202602 |
| DMSO | Finnzymes (NEB) | F-540S (part of kit) |
| EDTA (25 mM) | Invitrogen | 18068-015 (part of kit) |
| Tris | Roth | 4855.2 |
| Ampicilin sodium salt | Roth | K029.2 |
| dNTPs (10 mM, 100 μl) | Invitrogen | 18427013 |
| Iodixanol (OptiPrep) | Axis-shield | 1114739 |
| Phenolred | Merck | 107241 |
| Plasmid mega prep kit | Qiagen | 12181 |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Optima L90K |
| Quick-Seal centrifuge tubes | Beckman-Coulter | 342414 |
| Electroporation unit | Bio-Rad | GenePulserXcell |
| Thermal cycler | Eppendorf | Vapo Protect |
| Heating block | BIOER | MB-102 |
| Fluorescence microscope | Olympus | IX81 |
| FACS analyser | Beckman-Coulter | Cytomics FC500 MLP |
| MegaX DH10B T1R cells | Invitrogen | C640003 |
| Benzonase | Merck | 101695 |
| Adenovirus-5 | ATCC | VR-5 |
| pBlueScript II KS(+) plasmid | Stratagene | 212207 |
| cap5F (Pac I site in yellow, cap5-specific sequences in bold): GACTCTTAATTAACAGGTATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC |
IDTDNA | Custom primer |
| cap5R (Asc I site in green, cap5-specific sequences in bold): GTGAGGGCGCGCCTTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC |
IDTDNA | Custom primer |
References
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