דיפוזיה Exocytosis לרוחב של חלבונים בממברנה של נוירונים בתרבית הוערכה באמצעות שחזור פלואורסצנציה Fluorescence מסופקים Photobleaching

1. תרבית תאים, פרידמן וקיבל הד עולמי ויראלי, ואת ביטוי חלבון תרבות גבוהה צפיפות נוירונים בהיפוקמפוס של גורים ביום 18 (E18) עובריים להלשין על פולי-L-ליזין מצופים coverslips זכוכית עבור 14-25 ימים במבחנה (DIV). 6-24hrs לפני הניסויים חיים, תאים transduce עם וירוס Sindbis נחלש המכילים חלבון הקרום של עניין, מתויג עם סופר האקליפטית pHluorin (ספטמבר). הוסף בינוני pseudovirion המכיל ישירות coverslip המכיל 1mL של התקשורת מיזוג וחזר חממה התרבות. Titer וזמן לביטוי חלבונים לאחר התמרה ויראלית ישתנה בהתאם אצווה וירוס יש לקבוע עבור כל אצווה לפני התחלת ניסויים תא חי. 2. FRAP-FLIP תא חי דימות ציוד הגדרת העברת coverslip לחדר ההדמיה של מיקרוסקופ Axiovert Zeiss 510 LSM META confocal.כדי למזער תנודות מתח במהלך ההדמיה, להבטיח את המיקרוסקופ כבר מופעל, עם פלט לייזר 100%, לפחות 20 דקות לפני הדמיה. מיד להחליף את אמצעי עם התרבות מחומם מראש (37 ° C) הקלטה פתרון תאי המכיל 140 mM NaCl, KCl 5 מ"מ, 15 גלוקוז מ"מ, 1.5 מ"מ CaCl 2, 1.5 מ"מ MgCl 2, 20-25 HEPES מ"מ (pH מותאם 7.4 עם NaOH) ומקום קאמרית על הבמה מראש מחוממת (37 מעלות צלזיוס) של Axiovert Zeiss. להבטיח את osmolarity של פתרון ההקלטה תאי מותאם בתוך mOsM 10 בינוני התרבות שלך. אם אין אידוי משמעותית מתרחשת במהלך timecourse של הניסוי, זה הפתרון CO 2 עצמאית מתאים ניסויים קצרים (פחות מ 10 שעות). עם השלמת נתרן ביקרבונט 1-2 mM מומלץ. הגדרת פרמטרים לכידת הדמיה ראשית, לזהות את הבעת העצב Pro רקומביננטיטיין העניין ולהביא אותו אל המוקד. עם שמן 63X התנגד, לרכוש תמונה של התא כולו באמצעות עירור 488nm אור לייזר לייזר בהספק נמוך. כדי למזער photobleaching, להשתמש במהירות הנומינלית מהר (7-9) ואת פיקסלים ברזולוציה נמוכה (512-512) שמירה על מהירות סריקה הכולל <1 2. בחר חלק דנדריט לתמונה וזום ללכוד מסגרת המכילה את ההחזר על ההשקעה (~ 1.5-2.5 זום אופטי x). במידת האפשר, להבטיח שדה הראיה מכיל כמה תהליכים כדי מדידות של דנדריטים התייחסות ניתן להשיג, לקבוע אם הלא ספציפית photobleaching בשל רכישת מתרחש. התאם המסננים, חריר, מהירות סריקה רווח גלאי לאפשר הקרינה המרבית מ עירור הלייזר מינימלית אבל עם הרוויה מוגבלת. קוטר חריר גדול מומלץ, מנת למקסם אוסף פוטון (2μm מתאים קוצים והדנדריטים משולשת). צריך להיות חזק מספיק לזהות בהפרשים קטנים הקרינה,כך התמונות הראשונות, לפני לא להתגבר 10% פיקסלים רוויים. שמור התצורה הזו לשמש אקונומיקה שלאחר מראש > באיור 1. סכמטי של עקרונות FRAP לעומת FRAP כפכפי פרוטוקולים סכמטי זה מדגים את התוצאות של FRAP קבוע לעומת פרוטוקול "FRAP-פליפ", תוך שימוש בספט 'מתוייגים קולטנים. שחזור הקרינה ב FRAP המסורתית מוצגת בצד שמאל. שחזור הקרינה הנמדדת ההחזר על ההשקעה המרכזי מיוחסת לשילוב של פריץ לרוחב דיפוזיה לא photobleached קולטנים ספטמבר, מתוייגים מבחוץ ROI photobleached ואת הכניסה של קולטני באמצעות מיחזור ו / או דה נובו exocytosis לתוך פיר הדנדריטי. לעומת זאת, חוזרת ונשנית של photobleached ROIs איגוף לידי ביטוי בצד ימין, מראה עד כמה זה שונה "FRAP כפכפי" שתיקות פרוטוקול בשל התפשטות לרוחב התאוששות. לפיכך, שחזור כל הקרינה הנמדדת ניתן לייחס את ההכנסה ישירה ההחזר על ההשקעה. איור 2.הכניסה של ספטמבר-GluA2 לתוך קרום פלזמה על מוט הדנדריטי א) תא עצב בהיפוקמפוס להביע ספטמבר, GluA2, photobleached סלקטיבי יחד באזור של דנדריט. סכמטית ממחיש את האזור של דנדריט אשר צילמו, בעוד הפאנל העליון השמאלי מדגיש את ROIs כי נבחרו photobleaching. שטח גדול התאגרף לבן מולבן פעם אחת, ולאחר מכן חוזר על עצמו הלבנת האזורים משני צדי בארגזים, הדגיש עם כפולים חיצים כחולים ראשים. לוח זה מציג את דנדריט לפני photobleaching. החץ האדום מציין את ההחזר על ההשקעה מדוד, שמוצג בהגדלה גבוהה את לוחות נמוכות יותר. ב) מראה את עוצמת הקרינה ב ההחזר על ההשקעה נמדדת במשך זמן הניסוי, החליט ככל שרמת אפור ההחזר על ההשקעה (לא מנורמל). החץ השחור להדגיש timepoint של photobleach הראשוני החץ הירוק מציין את ההתחלה של photobleaching חוזר על עצמו. ΔF מציין הדואר הגדלת הקרינה נצפתה על תקופת ההחלמה, בשל הכניסה של ספטמבר-GluA2 לתוך פיר הדנדריטי. PH נמוך בעקבות ו pH 7.4 + NH 4 Cl שוטף לוודא את הקרינה התאושש מתייחס פני השטח קולטנים לידי ביטוי. איור 3. מיחזור & דיפוזיה לרוחב לעומת מחזור של ספטמבר-GluK2 על פיר הדנדריטי בעקבות הטיפול cyclohexamide א) תא עצב בהיפוקמפוס להביע ספטמבר, GluK2, photobleached סלקטיבי עם FRAP במקביל ופרוטוקולים התאוששות "FRAP כפכפי" שבוצעו לאורך ROIs הדנדריטים נפרד. תא עצב זה היה נתון המקדים עם cyclohexamide, כדי לחסום את סינתזת החלבון (2 שעות על 200 מיקרוגרם / מ"ל). סכמטית ממחיש את האזור של דנדריט אשר צילמו, ואילו לוח יד שמאל הדגשת ROIs כי נבחרו photobleaching. הדואר גדול באזור התאגרף לבן מולבן פעם אחת, ולאחר מכן חוזר על עצמו הלבנת האזורים הסמוכים, בארגזים של דנדריט נמוכה בלבד, הדגיש עם כפולים חיצים כחולים ראשים. לוח זה מציג את הדנדריטים לפני photobleaching. חיצים אדומים להדגיש את ROIs שמוצג בהגדלה גבוהה ב) הממחישות את ההתאוששות הקרינה ב FRAP המסורתית לעומת פרוטוקול "FRAP כפכפי". השוואת רמות של עוצמת הקרינה בשלב מאוחר של שחזור (לוחות שלישי) להראות את התרומה של דיפוזיה מיחזור לרוחב, לעומת מחזור לבד. C) מראה את עוצמת הקרינה ב ROIs נמדדת במשך זמן הניסוי, החליט כמו עוצמת מנורמל ערכים. החץ השחור להדגיש timepoint של photobleach הראשוני החץ הירוק מציין את ההתחלה של photobleaching חוזר על עצמו. ΔF rec מציין התאוששות זמנית עקב מיחזור הקולטן, נקבע בין דנדריט FRAP / פליפ תוך ΔFהבדל מודד את התרומה של פיזור רוחבי של ספטמבר-GluK2 לתוך פיר הדנדריטי ב 'FRAP רק "ההחזר על ההשקעה. גידול זמני ואחריו ירידה הדרגתית האות, המתאים בטווח מטה של ​​קולטני זמינים כתוצאה של טיפול cyclohexamide. PH נמוך לאחר מכן ו pH 7.4 + NH 4 Cl שוטף לוודא את הקרינה התאושש מתייחס פני השטח קולטנים לידי ביטוי.