Metodi per l'auto-somministrazione per via endovenosa in un modello murino

1. Di ricovero per animali e acclimatazione procedure Maschio e femmina CD-1 topi sono alloggiati con persone dello stesso sesso fratellini, fino a 5 animali per gabbia, in normali gabbie in plastica contenenti biancheria beta chip e pastiglie nestlet, con coperchio a griglia metallica per ospitare bottiglie d'acqua e cibo. Standard del mouse cibo e acqua ad libitum disponibili nelle gabbie casa tutto l'esperimento. I topi sono mantenuti su un reverse luce-buio di pianificazione (luci accese 22:00-10:00). I topi possono acclimatarsi sale prova le IVSA per una settimana prima dell'inizio delle procedure sperimentali. 2. Formazione operante Tutte le procedure comportamentali, compresa la formazione del latte zuccherato e per via endovenosa farmaci di auto-amministrazione sessioni vengono effettuate con camere di condizionamento operante di misura 15,9 x 14 x 12,7 cm, dotate di 2 ultra-sensibili leve del mouse, tazze bilanciere, luci di stimolo e pompe siringa microlitro (Med AssociAtes Inc., St. Albans, VT, USA). Chambers sono interfacciati ad un computer tramite Med Associates intelligente CR interfaccia e Med-PC software per programmare il calendario delle armature e raccogliere i dati. Topi ingenui sono abituati alle camere operante e addestrati a premere la leva con una ricompensa di latte zuccherato (0,1 ml) ha presentato in una tazza mestolo. Formazione latte operante è condotto in 1 ora sessioni per 5-7 giorni. Completamento di un rapporto fisso (FR) orario sulla leva attiva portato alla presentazione della coppa bilanciere e l'illuminazione di una luce stimolo. La soluzione consisteva in latte zuccherato, di saccarosio (10 mg / ml, Reagente ACS, Sigma-Aldrich Inc. St-Louis MO, USA) aggiunto al latte intero (3,25% di grassi). Formazione operante con una soluzione di latte zuccherato o un rinforzo cibo liquido è una tecnica comune utilizzata per facilitare rispondere operante in 1,2 topi. 3. Preparazione delle attrezzature da utilizzare durante l'intervento chirurgico Required attrezzature – 20, 23 e 26 aghi calibro, smerigliatrice, 1 cc siringhe, tubi Tygon, saldatore, eparina, antibiotici e analgesici. Preparare un ago per guidare l'inserimento del catetere nella vena giugulare di rasatura giù un ago da 20 gauge. L'albero dell'ago viene rasato utilizzando una smerigliatrice a formare un canale all'interno dell'ago per guidare il tubo del catetere nella vena. Il canale ago deve essere attentamente controllato per i residui metallici che potrebbero essere stati depositati. Eventuali ostacoli al canale deve essere prelevata con belle pinze a punta. Adattare due 1-cc siringhe da utilizzare per il lavaggio e controllando il catetere. Preparare due siringhe prendendo 12 pezzi cm di tubo Tygon e di collegarli ad una estremità a 26 aghi calibro fissate alle siringhe da 1 cc, e si estende le altre estremità del tubo più di 23 aghi calibro. Una siringa deve essere riempita con 0,9% di soluzione salina sterile e l'altra con una soluzione eparinizzata ticarcillina (33 mg di ticarcillinae 0,3 mg di eparina per 10 ml di soluzione fisiologica sterile). Preparare catetere tappi cannula. Tubo Tygon è tesa su un ago 23 gauge, e tagliare 1 cm dal smusso. Fondere l'estremità aperta del tubo per creare una tenuta spessa. Il tubo deve essere sciolto in modo che l'intero tappo cannula è abbastanza lungo per adattarsi sopra la cannula del catetere, con il raccordo terminale sigillato comodamente sul estremità della cannula. Si noti che se il tappo è troppo lungo, vi è il rischio che possa essere piegato e successivamente forata durante il processo di collegamento a vite sul catetere copre. Così accurata preparazione di tappi catetere è raccomandato, al fine di fornire una buona misura alla cannula. Preparare le soluzioni richieste. Tutti i reagenti sono acquistati da Sigma-Aldrich Inc. (St-Louis MO, USA). Eparinizzato Ticarcillin soluzione per il lavaggio del catetere – Sciogliere 0,33 g Ticarcillin (sale disodico) e 0,003 g di eparina in 10 ml di soluzione salina sterile. 0,03 ml di soluzione viene lavata through il catetere quotidiana. La soluzione antibiotico viene somministrato per prevenire la formazione di coaguli di sangue e infezioni in via di sviluppo. Amikicin (antibiotico) per iniezione sottocutanea – Una singola iniezione sottocutanea viene dato dopo intervento chirurgico alla dose di 10 mg / kg per prevenire infezioni post-operatorie. Ketoprofene (analgesico) per iniezione sottocutanea – Una singola iniezione sottocutanea viene dato dopo intervento chirurgico alla dose di 5 mg / kg per gestire qualsiasi dolore post-operatorio. 4. Catetere impianto Chirurgia Attrezzatura richiesta e reagenti: isoflurano, soluzione salina sterile, alcool (70%), 1 e 3 siringhe cc riempito con soluzione fisiologica sterile, 1-cc siringhe adeguate, soluzioni antibiotiche e analgesiche preparati al precedente punto 3, cateteri del mouse (CamCaths, Cambridgeshire, Regno Unito ), coperture catetere (tappi di cristallo di HRS scientifici, Montreal, Quebec), lubrificante occhio, 4 cm barra di plastica per elevare vena (questopuò essere costruito da un materiale plastico Q-tip), Polysporin, tamponi sterili e garze, pinze curve e rette, apposite pinze, forbici sottili. Utilizzo di tecniche standard di asepsi in panchina chirurgico, gli strumenti chirurgici, i cateteri e sono sterilizzati prima dell'intervento. Tecniche di sterilizzazione in autoclave a vapore sono corrette per gli strumenti chirurgici, cateteri acquistati da CamCaths. Perle di vetro sterilizzazione può essere utilizzato anche sulle punte degli strumenti chirurgici. Sterilizzazione con ossido di etilene può essere impiegato su cateteri più delicati o materiali che fusione rischio. Una descrizione più dettagliata delle tecniche chirurgiche asettiche roditore può essere trovato nel 1,2 allegata riferimenti. Impostazione del banco, strumenti e cono naso per l'anestesia di mantenimento è illustrato nella foto. I topi sono anestetizzati con isoflurano gas, e mantenuti sotto anestesia mediante un tubo di respirazione in un sistema scavenging. Lubrificante oculare (Lacrime Naturale PM) viene applicato a entrambi gli occhi per evitare che si secchi durante la procedura. Un margine adeguato chirurgica è rasata sul dorso dell'animale e intorno al collo. Prima di qualsiasi incisioni sono fatte, i campi chirurgici sono limitati con teli sterili. Al fine di preparare il catetere per l'inserimento nell'atrio destro del cuore, il tubo del catetere in eccesso viene tagliato 1,2 centimetri dal bulbo del catetere. Questa è la lunghezza ottimale stabilito per adulti topi CD-1, circa 8 settimane di età, 20-25 g di peso corporeo. La lunghezza del tubo di catetere può essere necessario modificare leggermente (per tentativi), in base alla dimensione ceppo, età e dei topi. Prima dell'inserimento, la siringa contenente soluzione salina sterile (sezione 3.2) è attaccato alla cannula del catetere e il catetere viene lavata e controllarne l'ermeticità. MantenereQuesta siringa collegata al catetere durante la procedura chirurgica. Esso verrà utilizzato per lavare il catetere, e aspiri sangue nel passo 4,7. Dopo la sterilizzazione con il 70% di alcool, una lunga incisione cm 2 midscapular è realizzato a partire metà strada sul retro e termina appena sotto il collo per ospitare la base del catetere. Il tessuto connettivo deve essere staccata con una pinza per fare spazio per la base catetere sotto la pelle. Posizionare l'animale sulla sua schiena, un poco profondo secondo 1-2 incisione cm diagonale è fatta dalla clavicola destra andando verso l'alto alla mascella gli animali, dopo che la zona è stata tamponata con il 70% di alcol. La vena giugulare sarà trovato superficialmente sotto la pelle del collo. In preparazione per l'inserimento del catetere, tubo dalla base del catetere viene tirato attraverso l'incisione sulla schiena e portato vicino alla vena giugulare passando il tubo sotto la pelle appena sopra la spalla destra. L'estremità del tubo del catetere èpoi collegato a un morsetto di arteria e posto a fianco dell'animale per tenerlo in posizione. La vena giugulare destra si trova delicatamente allontanandosi connettivo superficiale e tessuto adiposo dalla incisione intorno al collo dell'animale. Il tessuto connettivo attorno alla vena è spezzato con pinze curve e la vena viene poi elevato utilizzando una barra di plastica sterile. Sciolti nodi di sutura sono aperte attorno ciascuna estremità della vena e il tubo del catetere viene infilato attraverso il nodo superiore e allacciata al filo di sutura di riposare sbloccaggio sulla spalla destra. Prima dell'inserimento, bagnato sia l'inserimento dell'ago 20 gauge e vena con soluzione salina sterile per ridurre l'attrito. L'ago viene mantenuta parallela alla vena, e inserito dolcemente vicino al fondo della vena elevata (Nota: circa 0,5 cm della punta dell'ago deve inserire la vena). Utilizzando pinze, far scorrere il tubo del catetere giù l'albero dell'ago nella vena. Resistenza indicherebbe che il tubo is all'interno del tessuto connettivo e non all'interno della vena. Spingere 0,03 cc di soluzione fisiologica attraverso la vena per assicurarsi che non vi siano perdite. Perdite indicherebbe che la vena può essere forato o che il tubo di posizionamento del catetere deve essere regolato. Nota: Per verificare se il tubo è all'interno della vena, tentare di elaborare un po 'di sangue usando la siringa allegata salina. Se il sangue non può essere immediatamente redatto, la vena o parete cardiaca può occludere la punta del catetere, o la vena non è stato forato, regolare il tubo e riprovare. Ago reinserimento può essere necessario se il sangue non può ancora essere elaborati. Al fine di fissare il catetere in posizione, premere il bulbo catetere al punto di inserimento e rimuovere l'ago. Legare il nodo fondo e poi tirare il filo catetere contro la barra prima di legare la seconda a destra nodo sopra la lampadina. Prova di nuovo per vedere se il sangue può essere redatto e sciogliere i nodi leggermente se necessario. Infilare il tubo del catetere sotto la pelle e sutural'incisione ventrale intorno al collo dell'animale. Applicare Polysporin Heal veloce utilizzando un cotton-fioc sterile, o di qualsiasi altra pomata antibiotica preferibilmente contenente un po 'di analgesico per l'incisione chiusa. Con l'animale al addome, posizionare la base catetere sotto la pelle del dorso all'interno dell'incisione preparato. Assicurarsi che il tubo in eccesso viene minimamente in loop e ben nascosto sotto la base del catetere per ridurre al minimo le possibilità dell'animale masticazione e piercing. Suturare l'incisione su entrambi i lati della base catetere, e applicare rapidi Polysporin Heal utilizzando un applicatore con la punta di cotone sterile. Lavare il catetere da 0,03 cc di soluzione di eparina ticarcillina utilizzando la siringa con il tubo fissata ad esso (sezione 3.2). Chiudere la cannula con il tappo in plastica e cannula vite sul coperchio della catetere bianco. In alcuni topi che sono freschi dalla chirurgia, il sangue può fuoriuscire del catetere prima della cannula è ridotta. È importante ripristinare lavare l'animale e rapidly tappare cannula prima di sangue ha la possibilità di defluire. Gli animali devono essere lavati ogni giorno per mantenere la pervietà del catetere. Dopo aver pulito lungo la zona di iniezione tra gli animali gambe posteriori con 70% etanolo, sottocutanea iniettare il ketoprofene analgesico alla dose di 5 mg / kg su un lato, e l'antibiotico amikicin alla dose di 10 mg / kg sull'altro lato. Dopo l'anestesia viene interrotto, gli animali sono autorizzati a recuperare in una gabbia pulita, con facile accesso a cibo e acqua per 5 a 7 giorni. Topi deve essere posto in un armadio riscaldato durante la notte per evitare ipotermia post-operatorio. 5. Test comportamentale – per via endovenosa Self-Amministrazione Prima di cateteri di test comportamentali sono lavata con 0,9% di soluzione salina sterile. I topi sono quindi posizionared operante nelle camere e collegati alle linee di infusione e pompe di infusione. Presse a leva attivi comportare un secondo 3.2 18 microlitri infusione del farmaco accoppiato con l'illuminazione di una luce stimolo. Ogni pressa leva è seguito da un tempo di 8 sec out periodo durante il quale la luce stimolo rimane accesa. Dopo la sessione operante, cateteri topi sono lavata con la soluzione eparinizzata ticarcillina prima di essere restituiti alla loro gabbia casa. I topi sono autorizzati ad auto-somministrarsi per 3 ore consecutive 2-sessioni ad ogni dose. Le dosi sono stati presentati in un ordine casuale per ogni mouse, come mostrato nella sezione seguente. Pervietà del catetere è valutata giornalmente assicurando che sia la soluzione salina e antibiotici può essere lavata attraverso il catetere. In aggiunta, un ketamina / midazolam prova può essere effettuata come descritto nel riferimento allegato 5. In breve, i segni di anestesia come immobilità entro 5 secondi di una infusione di 0,02-0,03 ml ketamina (15 mg / ml),o midazolam (0,75 mg / ml), midazolam è la prova di un catetere brevetto 5.