الكشف عن الرشاشيات الرئوي الغازية في الخباثة المرضى باستخدام مكونات دم الاطراف تدفق التكنولوجيا
Summary
ويرد بسرعة ودقة نقطة من الرعاية اختبار لداء الرشاشيات الرئوي الغازية. فإنه يستفيد من الاطراف تدفق التكنولوجيا باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التي تربط محددة إلى<em> الرشاشيات</em> مستضد تفرز أثناء الالتهابات الرئوية. الفحص متوافق مع غسل الدم وbrochoalveolar، ويمثل اختبار مساعد رواية لتشخيص المرض.
Abstract
Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell transplant recipients1. Detection of IPA represents a formidable diagnostic challenge and, in the absence of a ‘gold standard’, relies on a combination of clinical data and microbiology and histopathology where feasible. Diagnosis of IPA must conform to the European Organization for Research and Treatment of Cancer and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycology Study Group (EORTC/MSG) consensus defining “proven”, “probable”, and “possible” invasive fungal diseases2. Currently, no nucleic acid-based tests have been externally validated for IPA detection and so polymerase chain reaction (PCR) is not included in current EORTC/MSG diagnostic criteria.
Identification of Aspergillus in histological sections is problematic because of similarities in hyphal morphologies with other invasive fungal pathogens3, and proven identification requires isolation of the etiologic agent in pure culture. Culture-based approaches rely on the availability of biopsy samples, but these are not always accessible in sick patients, and do not always yield viable propagules for culture when obtained.
An important feature in the pathogenesis of Aspergillus is angio-invasion, a trait that provides opportunities to track the fungus immunologically using tests that detect characteristic antigenic signatures molecules in serum and bronchoalveolar lavage (BAL) fluids. This has led to the development of the Platelia enzyme immunoassay (GM-EIA) that detects Aspergillus galactomannan and a ‘pan-fungal’ assay (Fungitell test) that detects the conserved fungal cell wall component (1 →3)-β-D-glucan, but not in the mucorales that lack this component in their cell walls1,4. Issues surrounding the accuracy of these tests1,4-6 has led to the recent development of next-generation monoclonal antibody (MAb)-based assays that detect surrogate markers of infection1,5.
Thornton5 recently described the generation of an Aspergillus-specific MAb (JF5) using hybridoma technology and its use to develop an immuno-chromatographic lateral-flow device (LFD) for the point-of-care (POC) diagnosis of IPA. A major advantage of the LFD is its ability to detect activity since MAb JF5 binds to an extracellular glycoprotein antigen that is secreted during active growth of the fungus only5. This is an important consideration when using fluids such as lung BAL for diagnosing IPA since Aspergillus spores are a common component of inhaled air. The utility of the device in diagnosing IPA has been demonstrated using an animal model of infection, where the LFD displayed improved sensitivity and specificity compared to the Platelia GM and Fungitell (1 → 3)-β-D-glucan assays7.
Here, we present a simple LFD procedure to detect Aspergillus antigen in human serum and BAL fluids. Its speed and accuracy provides a novel adjunct point-of-care test for diagnosis of IPA in haematological malignancy patients.
Protocol
Discussion
يمكن حقا فقط تحديد نهائي لمعهد الإدارة العامة أن يتحقق عن طريق العزل من وكيل خاص بأسباب الأمراض من عينات الخزعة، ولكن الانتعاش من عينات مناسبة غالبا ما يكون غير ممكن في المرضى مريض جدا وغير قابلة للاسترداد الرشاشيات نادرا من الدم. في حين تم إحراز تقدم كبير في مجال استخدام تصوير الشعاعي الطبقي محسوب المسح الضوئي من الصدر في تشخيص IPA، والخصائص التي توحي IPA الرئوية مثل "هالة" أو "الهواء الهلال" علامات عابرة أو يمكن أن تعزى إلى الأعمال الفنية في التنفس أو العدوى الفطرية الأخرى 11،12. وتستكمل لذلك مثل هذه البيانات مع التقنيات المصلية التي تهدف إلى التعرف على جزيئات توقيع (جنرال موتورز وβ غلوكان) من الفطريات التي تنتشر في مصل المريض أو التي تكون موجودة في سوائل BAL، البلغم أو عينات البول 13. في حين عرض هذه الاختبارات حساسية مرضية، وأنها تفتقر إلى الدقة الكافية أو تعاني من التدخل في ظل ظروف معينة 1،6 </sup>.
اختبار للكشف عن LFD IPA المقدمة هنا يمكن تشخيص 'نقطة من الرعاية "للتكنولوجيا معهد الإدارة العامة، ويستغل التي استخدمت حتى الآن في اختبارات للكشف عن الفيروسات والبكتيريا والطفيليات والسموم 14-19، وأشهرها، لاختبارات الحمل المنزلية لأول مرة من قبل Unipath في عام 1988. في LFD الرشاشيات وصفها هنا، وثبتوا على الرشاشيات محددة ماب JF5 إلى منطقة القبض على (خط اختبار) على غشاء النيتروسليلوز التي يسهل اختراقها. خدم لمكافحة فأر المناعي يجمد على الغشاء في منطقة منفصلة باعتبارها الرقابة الداخلية (خط السيطرة). بالإضافة إلى ذلك على السائل المصل أو BAL الى ميناء الإفراج عنهم، MAB المتقارن الذهب JF5-الغروية في لوحة الافراج بربط المستضد الهدف ومعقدة ثم يمر على طول غشاء يسهل اختراقها من قبل عمل شعري. ماب JF5 ثبتوا في منطقة التقاط بربط مجمع الذهب مستضد JF5-الغروية مما أدى إلى اختبار الخط الأحمر. أي غير منضم JF5-غرواني الذهبالمتقارن بربط الرقابة الداخلية مشيرا الى ان الفحص قد تعمل بشكل صحيح. هذه النتائج في مراقبة خط أحمر.
اختبار سريع، مع 15 دقيقة فقط على القيام بها، هي رخيصة مقارنة مع اختبارات مصل الدم وبال على أساس جنرال موتورز وكشف β غلوكان، ولا تتطلب معدات باهظة الثمن أو مرافق المختبرات واسعة للتشغيل. وعلاوة على ذلك، MAB JF5 لا مع المخدرات أو الملوثات التي ثبت أن يسبب رد فعل إيجابية كاذبة في جنرال موتورز وβ غلوكان الاختبارات 1،4،6 عبر رد فعل. ميزة إضافية كبيرة خلال التشخيص الحالية هي القدرة LFDs للكشف عن النشاط الذي يدل على نمو الغازية للأنواع الرشاشيات.
والخطوة الحاسمة في إجراء LFD هو الحاجة إلى قراءة نتائج 15 دقيقة بعد تطبيق عينة مصل أو BAL إلى الجهاز. لا ينبغي أن تترك للاختبار لمدة أطول من 15 دقيقة قبل ان يسجل نتائج، وهذه النتيجة قد interpretati التحيزفي. وليس رد فعل ضعيف أن يتعزز من خلال تمديد فترة الحضانة. تم العثور على المعالجة الحرارية للمصل من النماذج الحيوانية من الإصابة لتحسين حساسية الفحص. وجود قيود على اختبار هو أنه من النوعية، وتعتمد على المشغل لإجراء تقييم ذاتي من الإيجابية. كثافة خط اختبار ويختلف وفقا لمحتويات المستضد من عينات المصل وبال (الشكل 1). ومع ذلك، فإن أي رد فعل إيجابي (يحدده مقارنة السلبيات معروفة) يدل على وجود مستضد الرشاشيات، وبالتالي الإصابة. للحد من الذاتية من المقايسات LFD، الأجهزة المحمولة المتاحة التي تسمح الكمي للLFD كثافات اختبار الخط وتمكنها من وضع القيم عتبة الكشف عن مستضد 20.
التطورات المستقبلية للLFD تشمل التسويق وتطوير LFD متعددة تتيح كشف في وقت واحد من مسببات الأمراض الأخرى الفطرية الغازيةباستخدام MABS محددة للغاية 3.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
التمويل لثورنتون الدكتور المحدودة من شركة فايزر على ما قدمه.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Aspergillus LFD | University of Exeter | Available from the corresponding author on request | |
| RPMI-1640 | Sigma | R0883 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| Fetal calf serum | Biosera | S9100 | Other sources of fetal calf serum can be used in the preparation of TCM |
| EDTA | Fisher Scientific | BPE120-1 |
References
- Thornton, C. R. Detection of invasive aspergillosis. Adv. Appl. Microbiol. 70, 187-216 (2010).
- De Pauw, B., Walsh, T. J., Donnelly, J. P. Revised definitions of invasive fungal disease from the European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycology Study Group (EORTC/MSG) concensus group. Clin. Infect. Dis. 46, 1813-1821 (2008).
- Thornton, C. R. Tracking the emerging human pathogen Pseudallescheria boydii by using highly specific monoclonal antibodies. Clin. Vacc. Immunol. 16, 756-764 (2009).
- Pickering, J. W. +3)-β-D-glucan+assay+for+diagnosis+of+invasive+fungal+infections.”>Evaluation of a (1 -> 3)-β-D-glucan assay for diagnosis of invasive fungal infections. J. Clin. Microbiol. 43, 5957-5962 (2005).
- Thornton, C. R. Development of an immunochromatographic lateral-flow device for rapid serodiagnosis of invasive aspergillosis. Clin. Vacc. Immunol. 15, 1095-1105 (2008).
- Verweij, P. E., Mennink-Kersten, M. A. S. H. Issues with galactomannan testing. Med. Mycol. 44, 179-183 (2006).
- Wiederhold, N. P. +3)-β-D-glucan+assays+for+detection+of+invasive+pulmonary+aspergillosis.”>Comparison of lateral flow technology and galactomannan and (1 -> 3)-β-D-glucan assays for detection of invasive pulmonary aspergillosis. Clin. Vacc. Immunol. 16, 1844-1846 (2009).
- Johnson, G. L., Bibby, D., Bustin, S. Detection of Aspergillus in broncho-alveolar lavage fluid using two biological assays; evidence of active infection. Mycoses. 54, 130-131 (2011).
- Malani, A. Candida glabrata fungemia: experience in a tertiary care centre. Clin. Infect. Dis. 41, 975-981 (2005).
- Ascioglu, S. Defining opportunistic invasive fungal infection in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international concensus. Clin. Infect. Dis. 34, 71-74 (2002).
- Denning, D. Early diagnosis of invasive aspergillosis. Lancet. 355, 423-424 (2000).
- Greene, R., Shibuya, K., Ando, T., Latge, J. -. P., Steinbach, W. J. . Aspergillus fumigatus and Aspergillosis. , 353-363 (2009).
- Klont, R. R., Mennink-Kersten, M. A. S. H., Verweij, P. E. Utility of Aspergillus antigen detection in specimens other than serum samples. Clin. Infect. Dis. 39, 1467-1474 (2004).
- Iweala, O. I. HIV diagnostic tests: an overview. Contraception. 70, 141-147 (2004).
- Ketema, F., Zeh, C., Edelman, D. C. Assessment of the performance of a rapid, lateral flow assay for the detection of antibodies to HIV. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 27, 63-70 (2001).
- Moody, A. Rapid diagnostic tests for malaria parasites. Clin. Microbiol. Rev. 15, 66-78 (2002).
- Parkash, O. Performance of a lateral flow test for the detection of leprosy patients in India. J. Med. Microbiol. 57, 130-132 (2008).
- Sharma, S. K. Evaluation of lateral-flow Clostridium botulinum neurotoxin detection kits for food analysis. Appl. Environ. Microbiol. 71, 3935-3941 (2005).
- Smits, H. L. Lateral-flow assay for rapid serodiagnosis of human leptospirosis. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8, 166-169 (2001).
- Faulstich, K., Wong, R., Tse, H. . Lateral Flow Immunoassay. , 157-185 (2009).
