Yanal-flow teknolojisi kullanılarak Hematolojik Malignite Hastalarda invaziv pulmoner aspergillozis Algılama

1. Toplama, Depolama ve Serum ve Bronkoalveoler Lavaj Akışkanlar hazırlanması 4 pıhtılaşmasına kullanmak ° C, ve -20 azından alikotları olarak deposu serum ° C'ye önceden kan izin vererek tedavi edilmemiş kan örneklerinden serum Collect. Bronkoalveoler lavaj sıvıları (BAL) de -20 ° C'de alikotları olarak saklanmalıdır Not: Depolama serum ve alikotları tekrar test sırasında numunelerin donma-çözülme tekrarlanan tarafından hedef antijen bozulması için potansiyel sınırlar olarak BAL. Çözülme örnekler ve 14,000 rpm'de 1 dakika vorteks ve santrifüj ile iyice serum ve BAL örnekleri karıştırın. Insan serum numuneleri rutin testi için, doku kültürü ortamı (TCM) ile serum 01:01 (v / v) seyreltik. TCM RPMI-1640 ortamı, 10% (v / v) fetal buzağı serumu, 200mm L-glutamin solüsyonu 1% (v / v) ve koruyucu madde olarak, sodyum azid (% 0.02 w / v) oluşur. Orta önceden hazırlanmış ve birkaç ay süreyle 4 ° C'de saklanabilir. Dilut 100 ul uygulayınLFD için ed serum. Insan BAL sıvılarında, ve hayvan modelleri BAL sıvılarında için, hiçbir tedavi öncesi ile, LFD için düzgün numune 100 ul geçerlidir. Hayvan modellerinde serum için, fosfat EDTA, kaynar su banyosunda, 14.000 rpm'de 5 dakika boyunca santrifüj 3dk için ısı% 4 (w / v) içeren tamponlu salin ile serum 01:02 (v / v) seyreltilmiş ve 100 uygulamak LFD cihaza düzgün süpernatan ul. 2. Yanal akış Aygıt serum ve BAL Uygulama Oda sıcaklığında (23 ° C) yanal akış cihazlar depolamak. Bu sıcaklıkta, cihazlar 12 ay stabildir. Bir yüzey üzerinde kendi keseleri ve yerden aygıtları kaldırın. Steril bir pipet ucu kullanarak, cihazının açıklaması portuna önişlemli serum veya neat BAL Örnek 100 ul uygulanır. Assay testlerin sonuçları kaydedilmiş hangi bir zamanda oda sıcaklığında 15 dakika boyunca çalışmasına izin verir. Not: saniye içinde sıvı se olacaktırtr gözlem penceresinde Nitroselüloz zar boyunca kılcal hareket ile geçirmek. 3. LFD Sonuçlar kaydedilmesi ve yorumlanması LFD bir iç kontrol hattı (plastik gövde üzerinde C harfi ile gösterilir) ve bir test çizgisi (T harfi ile gösterilir) oluşur. Kontrol çizgisi her zaman serum veya BAL örneğinde bakılmaksızın Aspergillus antijeni görünmelidir. Bu tahlil doğru çalıştığını gösterir. Aspergillus antijeni serum veya BAL örnek varsa, test çizgisi de örnek uygulama 15 dakika içinde görünür. Test çizgisi yoğunluğu örnek Aspergillus antijeni mevcut miktarı ile orantılı olduğundan, test çizgisi (+) zayıf pozitif olarak görünebilir, orta pozitif (+ +) veya gibi güçlü bir pozitif (+ + +) . Ancak, herhangi bir pozitif test çizgisi ne olursa olsun, şiddeti, örnek Aspergillus antijeni varlığı işaret eder. ThAspergillus antijeni e yokluğunda, hiçbir test çizgi görünür, ve sonuç negatif olarak kaydedilir (-). 4. Temsilcisi Sonuçlar BAL ve serum numuneleri negatif, zayıf bir pozitif, orta pozitif ve güçlü bir pozitif LFD sonuçlar için temsili örnekler, Şekil 1 'de gösterilmiştir. (AML) hastalarda EORTC / MSG tanı kriterlerine göre tanı akut myeloid lösemi BAL sıvılarında kullanarak antijeni pozitif LFD testleri (güçlü ve zayıf) veya negatif LFD testlerin sonuçları Tablo 1'de verilmiştir. Ilgili klinik ve mikolojik (galaktomannan ve kültür) verileri ve her hasta için St Bartholomews Hastanesi'nde 8 de geliştirilen bir Aspergillus spesifik PCR testinin sonuçları bu tabloya eklenmiştir. Hastalığın tanısı ana faktörler (nötropeni, kortikosteroidlerin uzun süreli kullanımı, diğer tanınan T-hücre immunos ile tedavi dayanmaktadıruppressants), klinik kriterler ve BAL için GM pozitifliği (burada bir GM endeks değeri> 0.8 olarak tanımlanır). 2002 EORTC / MSG kılavuzlar 10, hastalar 12, 13 ve 16 altında konak faktörleri ve klinik kriterleri ya da GM pozitifliği temelinde 'mümkün' IA tanısı konuldu. Sırasıyla klinik veriler ve mikoloji gelen destekleyici kanıt eşliğinde sürece gözden geçirilmiş (2008) EORTC / MSG kurallarına 2, konak faktörleri ve GM pozitifliği tek başına veya konak faktörleri ve sadece klinik kriterlerine göre 'olası' invaziv fungal enfeksiyon belirtisi değildir. Hasta 6 çünkü ana faktörler, majör ve minör klinik özellikleri ve GM pozitifliği hem de 2002 ve 2008 kuralları uyarınca "muhtemel" IA tanısı kondu. Not, bu LFD ya PCR ne de henüz EORTC / MSG kılavuzlar dahil edilir ise, örnek olarak BAL Aspergillus antijen ve nükleik asit varlığında gösteren iki deneyleri ve ticari galaktomannan test arasında güçlü bir uyum olduğu Hastaların 6 ve 12 ile s. IPA tanısında LFD ve PCR etkinliğini ortaya koyan çalışmaların Ek sonuçların Johnson ve ark 8 bulunabilir. Şekil 1. Serum ve BAL kullanarak LFD testlerin sonuçları (kontrol ve test çizgisi) Negatif (sadece kontrol hattı) ve pozitif. Test hattı reaksiyon yoğunlukları ve serum numuneleri BAL hedef antijene konsantrasyonları ile orantılıdır. Reaksiyonlar tipik olarak aralıktan zayıf bir (+) orta yoluyla (+) kuvvetli (+ + +). Ne olursa olsun test hattı yoğunluğu, her üç serum pozitif reaksiyon kan Aspergillus antijeni dolaşan varlığı nedeniyle invaziv pulmoner aspergillozis hastalığı işaret eder. Pozitif BAL reaksiyonlar (zayıf, orta veya güçlü) sporlar ve akciğerlerde potansiyel patojen hif gelişme çimlenme işaret eder. "pdflinebreak> Hasta hayır. Patient bilgi Klinik kriterler 1 BAL kültürü 2 GM ÇED endeksi 3 EORTC / MSG (2002) 4 EORTC / MSG (2008) 5 Aspergillus PCR sonucu LFD sonucu 6 – Binbaşı CT bulguları (nodül ve halo) ve küçük bir Negatif 0.9 (pozitif) Muhtemel Muhtemel Pozitif (+) Pozitif Zayıf 12 Presumed önceki mantar enfeksiyonu Minör majör bir Candida glabrata 6.43 (kuvvetli pozitif) Mümkün Hiçbiri Pozitif Güçlü pozitif (+ + +) 13 Koagülaz-negatif Staphylococcus ve E. Kanda coli Hayır majör, iki minör Negatif 0,25 (negatif) Mümkün Hiçbiri Negatif Negatif (-) 16 Akciğer enfeksiyonu Yeni sızmak artı çoğul efüzyon dahil 3 minör kriterin Negatif 0,16 (negatif) Mümkün Hiçbiri Negatif Negatif (-) Bilgisayarlı tomografi 1 Nodüller veya haleler mantar enfeksiyonu düşündürür Bu normal insan florasının 9 parçası olarak izole ikinci en sık görülen maya olarak BAL sıvısında 2 Candida glabrata bir kirletici olarak kabul edilir BAL GM ÇED test> 0.8 3 indeks Aspergillus enfeksiyonunun göstergesidir 4 'yaklaşıma uygun olan 2002 EORTC / MSG tanı kriterlerine göree ',' olası 'veya' kanıtlanmış invaziv mantar hastalığıdır 10 5 'olası' için gözden geçirilmiş (2008) EORTC / MSG tanı kriterleri, 'olası' veya 'kanıtlanmış' invaziv mantar hastalığıdır 2 dayanarak Tablo 1. LFD muhtemel IPA ile ve kontrol AML hastalarında (enfeksiyon bulgusu) akut myeloid lösemi hastalarının BAL örneklerinin testleri, ve enfeksiyon EORTC / MSG tanı sonuçları.