Détection de l'aspergillose pulmonaire invasive chez les patients hémopathie maligne en utilisant la technologie de flux latéral-

1. Collecte, stockage et préparation de sérum et les fluides de lavage broncho- Recueillir le sérum à partir d'échantillons sanguins non traités en permettant la coagulation du sang à 4 ° C, et le sérum magasin comme aliquots à -20 ° C avant de les utiliser. Broncho-alvéolaire (LBA fluides) devrait également être stockées sous forme de fractions aliquotes à -20 ° C. Remarque: stockage de sérum et de BAL comme aliquotes limite le potentiel de dégradation de l'antigène cible par la répétition de congélation-décongélation des échantillons au cours des tests répétés. Faire dégeler les échantillons et mélanger les échantillons de sérum et de BAL soigneusement au vortex et centrifuger pendant 1 min à 14000 rpm. Pour les tests de routine des échantillons de sérum humain, diluer le sérum 01:01 (v / v) avec un milieu de culture de tissus (TCM). TCM est constitué de milieu RPMI-1640, 10% (v / v) de sérum de veau foetal, 1% (v / v) de la L-glutamine 200 mM solution, et de l'azoture de sodium 0,02% (m / v) en tant que conservateur. Le milieu est préparé à l'avance et peuvent être conservés à 4 ° C pendant plusieurs mois. Appliquer 100 pi de la DILUTed sérum à la LFD. Pour l'homme liquides de LBA, et pour les fluides BAL de modèles animaux, appliquer 100 pi d'échantillon propre à l'écoute des nouvelles orientations, sans pré-traitement. Pour le sérum à partir de modèles animaux, diluer le sérum 1:2 (v / v) avec un tampon phosphate salin contenant 4% (p / v) d'EDTA, de la chaleur pour 3min dans un bain d'eau bouillante, centrifugeuse pendant 5 min à 14000 rpm, et appliquer 100 ul de surnageant soignée à l'appareil LFD. 2. Application de sérum et de BAL sur le périphérique latérale-débit Stocker les dispositifs latéraux d'écoulement à la température ambiante (23 ° C). A cette température, les appareils sont stables pendant 12 mois. Supprimez les périphériques de leurs poches et les placer sur une surface plane. Utilisation d'un embout de pipette stérile, appliquer 100 pl de pré-traitée échantillon de sérum ou de BAL pur à l'orifice de libération du dispositif. Permettre à l'essai pour une durée de 15 min à température ambiante, au moment où les résultats des tests doivent être consignés. Remarque: En quelques secondes, le liquide sera soifr à migrer par capillarité le long de la membrane de nitrocellulose dans la fenêtre d'observation. 3. Enregistrement et interprétation des résultats LFD Le LFD consiste d'une ligne de commande interne (indiquée par la lettre C sur le boîtier en matière plastique) et une ligne de test (indiquée par la lettre T). La ligne de commande doit toujours apparaître, indépendamment de l'antigène Aspergillus dans l'échantillon de sérum ou de BAL. Cela montre que le test a fonctionner correctement. Si l'antigène Aspergillus est présent dans l'échantillon de sérum ou de BAL, la ligne de test apparaît également dans 15min d'application d'échantillon. Parce que l'intensité de la ligne de test est proportionnelle à la quantité d'antigène présente dans l'échantillon d'Aspergillus, la ligne de test peut apparaître en tant que faiblement positif (+), une moyenne positif (+ +) ou comme une forte positif (+ + +) . Toutefois, aucune ligne de test positif, quel que soit l'intensité, d'indiquer la présence de l'antigène Aspergillus dans l'échantillon. En el'absence de l'antigène e Aspergillus, aucune ligne de test s'affiche, et le résultat est enregistré comme négatif (-). 4. Les résultats représentatifs Des exemples représentatifs de négatifs, faiblement positif, positif modéré, et fort des résultats positifs avec des échantillons LFD BAL et le sérum sont présentés dans la figure 1. Résultats de l'antigène de tests positifs pour RAJ (faible et forte) ou négatifs des tests utilisant des fluides LFD BAL de leucémie myéloïde aiguë (LMA) patients diagnostiqués selon l'EORTC / MSG critères diagnostiques sont indiqués dans le tableau 1. Inclus dans ce tableau sont les correspondants clinique et mycologique (galactomannane et de la culture) de données, et les résultats d'un test de PCR spécifique d'Aspergillus mis au point à Saint-Barthélémy Hôpital 8, pour chaque patient. Le diagnostic de la maladie a été fondée sur des facteurs d'accueil (neutropénie, l'utilisation prolongée de corticostéroïdes, le traitement avec d'autres reconnus des cellules T immunosuppressants), les critères cliniques et de positivité pour GM BAL (définie ici comme une valeur d'indice GM> 0,8). Sous les 2002 EORTC / MSG lignes directrices 10, 12 patients, 13 et 16 ont été diagnostiqués avec «possible» IA sur la base de facteurs de l'hôte et les critères cliniques ou de positivité GM. Selon la version révisée (2008) EORTC / MSG directives 2, facteurs de l'hôte et la positivité GM seuls ou facteurs de l'hôte et les critères cliniques ne suffiraient pas à indiquer «possible» infection fongique invasive moins d'être accompagné par les pièces justificatives à partir de données cliniques et mycologiques, respectivement. Patient 6 a été diagnostiqué avec «probable» IA dans les deux 2002 et 2008 des lignes directrices en raison de facteurs de l'hôte, majeurs et mineurs des caractéristiques cliniques et la positivité GM. Notez que tandis que ni la LFD, ni PCR sont actuellement inclus dans les lignes directrices EORTC / MSG, il ya une grande concordance entre les deux tests et le test commercial galactomannane indiquant la présence de l'antigène Aspergillus et de l'acide nucléique dans l'échantillon BAL s de patients 6 et 12. D'autres résultats d'essais démontrant l'efficacité des tests LFD et PCR dans le diagnostic IPA peuvent être trouvés dans Johnson et al 8. Figure 1. Négatif (ligne de commande uniquement) et positif (contrôle et test en ligne) les résultats des tests de LFD utilisant du sérum et BAL. Les intensités des réactions de ligne de test sont proportionnelles à la concentration de l'antigène cible dans les échantillons de sérum et BAL. Réactions varient généralement de faible (+) par le biais modérée (+ +) à forte (+ + +). Indépendamment de l'intensité de ligne de test, tous trois sérum réaction positive indique invasif maladie pulmonaire aspergillose due à la présence d'antigènes circulants dans le sang d'Aspergillus. Des réactions positives BAL (faible, modérée ou forte) indiquerait la germination des spores et le développement des hyphes potentiellement pathogène dans les poumons. pdflinebreak "> Aucun patient. Patient l'information Les critères cliniques 1 La culture BAL 2 GM EIE indice 3 EORTC / MSG (2002) 4 EORTC / MSG (2008) 5 Aspergillus PCR résultat Résultat LFD 6 – Principaux signes TDM (nodule et halo) et une mineure Négatif 0,9 (positif) Probable Probable Positif Faiblement positif (+) 12 Présumé infection fongique précédente Aucune modification importante, un mineur Candida glabrata 6,43 (très positif) Possible Aucun Positif Fortement positive (+ + +) 13 Staph à coagulase négativeylococcus et E. coli dans le sang Aucune modification importante, deux mineures Négatif 0,25 (négative) Possible Aucun Négatif Négatif (-) 16 Infection à la poitrine 3 critères mineurs, y compris épanchement pluriel nouvel infiltrat en plus Négatif 0,16 (négative) Possible Aucun Négatif Négatif (-) 1 nodules ou des halos sur une tomodensitométrie est évocatrice d'une infection fongique 2 Candida glabrata dans le liquide BAL serait considérée comme un contaminant, en est la levure deuxième plus fréquemment isolé dans le cadre de la flore normale de l'homme 9 3 Un indice de> 0,8 dans le test de GM EIE du BAL est révélatrice de l'infection Aspergillus 4 Basé sur les 2002 EORTC / MSG critères diagnostiques pour 'possible »,« probable »ou« prouvée »la maladie fongique invasive 10 5 Basé sur la version révisée (2008) EORTC / MSG critères diagnostiques de la «possible», «probable» ou «prouvée» la maladie fongique invasive 2 Tableau 1. Les résultats des tests d'échantillons LFD BAL de la leucémie myéloïde aiguë avec IPA probable et de patients atteints de LAM de contrôle (aucun signe d'infection) et l'EORTC / MSG diagnostic de l'infection.