اختبار المقايسة المناعية المضاعفة فلوروميتريك المنهجية واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

1. شرح للإجراءات MFIA (الشكل 1) ويتطلب MFIA تشارلز ريفر مستضد المغلفة المجهرية البوليسترين (الخرز)، سيرا الاختبار والكواشف المسمى (BAG، SPE) ومخازن (مخفف الابتدائية، عازلة الفحص). تتم إضافة الكواشف تدريجي إلى الآبار من 96 بئر وحات microtiter مرشح القاع. يتم تنفيذ MFIA كما يتم اتباع معنى الاختبار غير متجانسة من حضانات مرشح غسل خطوات لإزالة مكونات المصل أو غير منضم المسمى الكواشف. وأضاف حل لغسل الآبار تتم إزالة لوحة من الطموح من خلال قيعان تصفية جيدا، والتي تحتفظ الخرز. يتم تنفيذ المقايسات MFIA في درجة حرارة الغرفة (27 ° C + / -2 ° C). تم الكشف عن مستضد الضد مجمعات شكلت خلال اختبار المصل حضانة الخطوة من قبل حضانات مع المعقدة البيروكسيديز تقارن مكافحة الأنواع الماعز (BAG)، يليه R-فيكوإيريترين التي تحمل علامات streptavidin (SPE). في مقايسة للقارئ، وحبات تمر في وقت واحد من خلالكاشف حيث يتعرضون لاثنين من أشعة الليزر. واحد ليزر الأصباغ الداخلية يثير التي تحدد مجموعة من حبة في لون، والتي تتطابق إلى فحص، والآخر يثير الصبغة مراسل فيكوإيريترين ألقي القبض عليهم أثناء الفحص. تتم قراءة عدد محدد سلفا من الخرز في الفحص وذكرت وكثافة مضان فيكوإيريترين باعتباره مؤشر متوسط ​​الإسفار (MFI). الشكل 1. MFIA الداخلي. وMFIA xMAP القائم هو الذي يستخدم التعليق ميكروأري مرمزة الخرز البوليسترين ميكرون 5.6 إلى التي ترتبط تساهميا المستضدات (أو الضوابط). منذ الخرز يأتي في 100 مجموعة متميزة اللون، يمكن إجراء ما يصل الى 100 المقايسات مختلفة في الخطوات الفحص جيدا واحدة يتم تنفيذها في وحات microtiter مرشح القاع بحيث يمكن غسلها بواسطة الخرز تطلع على مشعب فراغ. تتم قراءة ردود الفعل مع مقياس التألق LUMINEX 100 xMAP. شدة phycoerytوتفيد التقارير بأنه hrin مضان مضان مؤشر متوسط ​​(MFI) 2. قبل الشروع في العمل يرجى ملاحظة ما يلي: حبات MFIA خفيفة الحساسة الحد من كمية التعرض للضوء المباشر أمر بالغ الأهمية. الكمية المعتادة من التعرض للضوء التي تحدث أثناء الفحص الروتيني هو مقبول ولكن التعرض لفترات طويلة يمكن أن يؤدي إلى photobleaching من الخرز التي تجعلها غير قابلة للقراءة من قبل القارئ الفحص. من الأهمية بمكان لنجاح الفحص التي vortexed دائما الخرز MFIA في التعليق ثم sonicated (10-30 ثانية) قبل استخدامها. القارئ الفحص تجمع المعلومات من الخرز واحد فقط. يمكن للمجموعات مجمعة حبة تؤدي إلى قراءة أوقات أطول. تأكد للحفاظ على لوحة الاختبار مغطاة غطاء لوحة خلال جميع الخطوات لتجنب التبخر الحضانة من الحلول الفحص. معدات الوقاية الشخصية المطلوبة: مختبر معطف، GLيجب ارتداء OVES وحماية العين في جميع الأوقات أثناء العمل في بيئة معملية. 3. الكواشف الجدول 1 يشمل معظم المواد اللازمة لإنشاء مختبر MFIA في المنزل. قد بنود إضافية أو مكررة يكون من الضروري تبعا للاحتياجات المحددة الخاصة بك. يرجى ملاحظة أن هذا المخزون يستبعد الكواشف التي تم شراؤها من نهر تشارلز (الخرز MFIA والضوابط والكواشف التكميلي). مصادر تجارية عدة تقارن المعقدة البيروكسيديز وstreptavidin فيكوإيريترين الموسومة المتاحة. ومع ذلك لا ينصح تم معاير الكواشف المتاحة من نهر تشارلز لانتاج إشارة الأمثل لدرجة الضوضاء مع الكواشف لدينا، وذلك باستخدام شركات بديلة أو كاشف الكثير. الجدول 1. CR-قاعدة بيانات طلبات العودة يستخدم مجموعة من تعليق القارئ BioPlex BioRad وغسالة آلية صفيحة ميكروسكوبية من بيوتيك. الأجهزة يعادل يتوفر البديل من البائعين. <tboدى> بند بائع كتالوج رقم معدات التعليق مجموعة القارئ * BioRad 171-000205 96-جيدا غسالة صفيحة ميكروسكوبية بيوتيك ELX50/8FMW بالموجات فوق الصوتية الأنظف / حمام كول بالمر EW0884900 التناظرية دوامة خلاط VWR 58816-121 -20 ° C الفريزر مختلف 4 ثلاجة ° C مختلف 12-قناة pipettor، 20-200μl VWR 83009-718 الصفيحة الحجاجية شاكر VWR / مختبر لاين 57019-600 قناة واحدة pipettors، 20-200μl، مع نصائح VWR 83009-732 قناة واحدة pipettors، 2-20μl، مع نصائح VWR 83009-726 قناة واحدة pipettors، 100-1000μl، مع نصائح VWR 83009-736 Vacushield تنفيس الجهاز VWR 55095-006 فراغ مضخة الضغط VWR 54908-037 خزان النفايات فراغ النظام VWR 80200-640 المستهلكات 96-polystryrene جيدا لوحة فيشر العلمية 14-245-145 متعددة الشاشات HTS-BV وحة، 1.2μm التصفية، الستايرين ميليبور MSBV N12 50 15ml المخروطية أنابيب (البولي بروبلين) Sarstedt 62554.002 50ML أنابيب مخروطية (البولي بروبلين) Sarstedt 62547.004 مصل قارورة Sarstedt 72694.007 رقائق الالومنيوم VWR 89079-068 زجاجات 1L، عقيمة VWR 28199-246 0.22μm زجاجة أعلى مرشحات VWR 28199-307 كاشف الخزانات (100ML) VWR 82026-356 5ml، 10ML، 25ml pipets عن إقامة الكواشف السائل VWR الكواشف PBS، درجة الحموضة 7.4 1 BSA، ومسحوق (الحقائب) سيجما P3813 ProClin 300 سيغما / Supelco 48912-U غير المصقول المجهرية LUMINEX تباينت استنادا إلى نوع 4. كاشف إعداد هناك حاجة لاثنين من مخازن الإجراء MFIA. مخفف الأساسي هو متاح من نهر تشارلز ويحتوي الملكية وكلاء عرقلة لخفض البروتين التفاعلات غير محددة. يتم فحص العازلة غسل في مرفق الخاص بك مع الكواشف المتاحة تجاريا. مقايسة غسل العازلة: PBS / BSA 1٪ درجة الحموضة 7.4 يتوفر على شكل مسحوق من سيغما الدريخ. إزالة الجسيمات عن طريق الترشيح أمر بالغ الأهمية لأن هذه الجسيمات يمكن أن يؤدي إلى قباقيب في القارئ الفحص. تصفية العازلة من خلال زجاجة 0.2micron أعلى وحدة التصفية وتوضع في حاويات معقمة المسمى. مخففة وBAG SPE لتركيز عملها في 2X العازلة غسل الفحص. ملاحظة: SPE هو الحساسية للضوء وSHولد لديها محدودة التعرض للضوء. 5. تحضير العينة تجميع مواد الاختبار الخاص بك والكواشف والمستهلكات. واحد متعدد القنوات micropipettes ونصائح 96-منخفضة جيدا لوحات البروتين ملزمة عيار مكروي (التخفيفات المصل) وألواح مرشح القاع (MFIA الفحص) جمع عينات الدم وفقا للإجراءات القياسية الخاصة بك. السماح للعينات الدم على التخثر بشكل كامل من خلال عقد لهم في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 30 دقيقة قبل الطرد المركزي وإزالة المصل. وينبغي vortexed Undilute المصل لفترة وجيزة لخلط المكونات المصل قبل أخذ العينات. التخفيف الاختبار النهائي لMFIA هو 1/50. من الضروري إجراء 2X (1/25) عينة من مصل الاختبار لفحص. اختبار الأمصال تمييع غير مخفف بإضافة جزء 1 إلى 24 مصل مخفف MFIA أجزاء الابتدائية. تنظيم المصل الاختبار الخاصة بك في لوحة عيار مكروي 96-جيدا يقلل بدرجة كبيرة من وقت نقل العينات الخاصة بك إلى قسم التدريب والامتحاناتينصح بشدة لوحة ور. 6. اختبار لوحة إعداد مطلوب قبل ترطيب لوحة اختبار 96-جيدا لضمان السليم، وأيضا حتى الاجلاء. حتى لو لن اللوحة بأكملها استخدامها مطلوب في البداية هذه الخطوة، سوف لا يكون لديك لإضافة كاشف لاحقة أو غسل العازلة للآبار فارغة. بعض المعامل تشغيل أقل من 96-وحة كاملة جيدا من خلال اغلاق الآبار غير المستخدمة على لوحة الاختبار وخطة لإعادة استخدام هذه الآبار في وقت لاحق. لا نوصي باستخدام هذه الطريقة لأنها قد تؤثر على الترشيح السليم لوحة الاختبار. تطلع لوحة الاختبار المناسب أمر حاسم لنجاح الفحص MFIA. يجب إخلاء الآبار عينة تأخذ 5-10 ثواني تقريبا. يمكن الشفط محتويات جيدا بسرعة كبيرة جدا تؤدي إلى تجميع حبة وبطيئة مرات قراءة في نهاية الفحص. لطخة الجانب السفلي من لوحة الاختبار مع المناشف الورقية بعد كل ثتوقف الرماد خطوة لضمان الصرف السائل. يمكن عدم صمة عار لوحة الاختبار يؤدي إلى الكواشف السائل فتل من الآبار خلال الحضانة ونتيجة عدم الماعز في مكافحة الأنواع و / أو الأنواع عشرات مفتش حبة. تم تصميم هذه الخرز ليسجل ضمن نطاق محدد مسبقا MFI عند إضافة كمية مناسبة من المصل الابتدائية والكواشف المسمى إلى كل بئر. 7. MFIA إعداد الخرزة تعليق من الأهمية بمكان لنجاح الفحص التي vortexed دائما الخرز وsonicated قبل استخدامها. القارئ الفحص تجمع المعلومات من الخرز واحدة فقط، ويمكن حبة أو كتل الركام يؤدي الى اطالة أمد القراءة والكتابة. دوامة السهم إلى جانب حبة التعليق (10 ± 5 ثوان عادة) إعادة تعليق الخرز تليها صوتنة في حمام لمدة 10-20 ثانية sonicator. تمييع الأسهم 20X التعليق على تعليق العمل في 2X حبة مخفف الابتدائية. الاستغناء 50μl تعليق العمل في حبة 2Xإلى كل مقايسة جيدا لوحة اختبار ما قبل الرطب. 8. إضافة سيرا اختبار ومراقبة لوحة اختبار ماصة 50μl من كل اختبار المصل 2X والتحكم على لوحة الاختبار يعتمد على خريطتك لوحة المعرفة مسبقا. آمنة غطاء لوحة مع شريط مطاطي أو رقائق الألومنيوم واحتضان لوحة الاختبار ل60minutes على شاكر المداري، في الظلام في درجة حرارة الغرفة. يجب أن تكون أكبر سرعة شاكر من 400 ولكن أقل من 700rpm. فمن الأهمية بمكان أن تظل حبات في تعليق للسماح الأجسام المضادة في مصل الدم الوصول إلى جميع أسطح مولدات المضادات جانب. والفشل في الحفاظ على حبات علقت يؤدي إلى انخفاض درجات مفتش الرقابة والفحص حبة سوف تحتاج إلى تكرار. 9. غسل لوحة اختبار نضح محتويات جيدا باستخدام متعددة فراغ. يجب إخلاء الآبار عينة تأخذ 5-10 ثواني تقريبا. لطخة الجانب السفلي من لوحة الاختبار مع بيبتوقف المناشف بعد كل ص لضمان الصرف السائل. إعادة تعليق الخرز في 50μl من غسل العازلة الفحص. من المهم أن لا يسمح للالخرز لتجف أثناء عملية الفحص. 10. مضيفا BAG وSPE إلى لوحة اختبار الاستغناء 50μl من 2X BAG تعمل على تخفيف جميع الآبار التي تحتوي على الخرز MFIA. تأمين غطاء لوحة مع شريط مطاطي أو رقائق الألومنيوم. احتضان لوحة الاختبار ل30minutes مع اهتزاز على النحو الوارد أعلاه، في الظلام في درجة حرارة الغرفة. بعد هذا حضانة غسل لوحة اختبار و resuspend الخرز مع العازلة غسل الفحص كما هو موضح سابقا بعد إضافة المصل. الاستغناء 50μl من 2X SPE تعمل على تخفيف جميع الآبار التي تحتوي على الخرز MFIA. تأمين غطاء لوحة مع شريط مطاطي أو رقائق الألومنيوم. احتضان لوحة الاختبار ل30minutes مع اهتزاز على النحو الوارد أعلاه، في الظلام في درجة حرارة الغرفة. بعد هذا incubation غسل لوحة اختبار و resuspend مع حبات من 125μl العازلة غسل الفحص ويهز لوحة لمدة دقيقتين ~ ل resuspend حبات قبل وضع القارئ في الفحص. 11. قراءة اللوحة اختبار وضع لوحة الاختبار إلى القارئ الفحص خلال 10 دقيقة من resuspending الخرز. في حالة انقطاع التيار الكهربائي أو واقعة أخرى، يمكن تخزين اللوحة اختبار في درجة حرارة الغرفة في الظلام تصل إلى 12 ساعة حتى جاهزة للقراءة. مراقبة العينة أول بئر للتحقق من أن لوحة مختارة حبة حبة يطابق الملف في آبار الاختبار. إذا كان هناك الخرز التي تقع خارج "المنطقة حبة اختارهم على الشاشة البروتوكول، تم إجراء اختيار الملف غير صحيح. إذا كان قد تم بشكل صحيح حبات معلق ينبغي أن ملء في 'المناطق' من المحدد المشار إليها في فحص البرمجيات القارئ. إذا يتم تجميع حبات فإنها تملأ في مناطقها في بطءمعدل. يمكنك إزالة لوحة الاختبار من القارئ و resuspend يدويا الآبار. يسحن كل بئر مع pipettor متعدد القنوات 3-4 مرات للمساعدة في تفكيك المجاميع حبة. استبدال لوحة الاختبار إلى القارئ ومتابعة. 12. ممثل النتائج وجاء في الحد الأدنى لعدد حبات في الفحص وذكرت وكثافة مضان فيكوإيريترين باعتباره مؤشر متوسط ​​الإسفار (MFI) تتراوح من 0 إلى 32667. بعد مقارنة تهم 25، 50 أو 100 حبات لكل بئر رأينا لا يوجد فرق إحصائي والاعتماد بشكل روتيني 25 حبات في كل عينة وكيل أيضا. النظر في تقرير النتائج للأخطاء، مثل عدم كفاية التهم حبة أو عدم مفتش / المضادة للمفتش عشرات حبة. تم تصميم هذه الخرز ل"نقاط" ضمن نطاق محدد مسبقا MFI عند إضافة كمية مناسبة من المصل الابتدائية والكواشف المسمى إلى كل بئر. عينة الآبار مع الأخطاء، (حبة التهم الأقل) أو عدم التحكم مفتش عشرات حبة ينبغيتتكرر للحصول على نتائج صحيحة. تصدير النتائج إلى ورقة عمل Excel. لتفسير البيانات المتوفرة لدينا يتم تعيين كل الفحص: A الأنسجة التحكم (TC) اختبار: بالنسبة لمعظم المقايسات MFIA القوارض، ومراقبة الأنسجة مقتطف من الخلايا المصابة الفيروسة العصوية من النوع البري الحشرات. بقطع الفحص: هذه القيمة هي الحد الأدنى المتوقع مضان ويتم ضبط لكل مقايسة لتعظيم دقة التشخيص. بالنسبة لمعظم المقايسات، وقطع الاستشعاع 3000. يتم احتساب صافي مؤشر متوسط ​​الإسفار (MFI) لكل فحص (باستثناء الأنسجة والاختبارات مفتش مراقبة) بواسطة الصيغة التالية. وبعبارة أخرى، فإن إشارة محددة مقايسة هو مجموع مؤسسات التمويل الأصغر فحص ناقص (الخلفية) MFI TC ثم يتم تقسيم هذه القيمة بحلول عام 1000 الذي يحدد ببساطة مجموعة من مؤسسات التمويل الأصغر بين 0-32 الصافي بدلا من 0-32،667. صافي = MFI (MFI الفحص جسم – MFI التحكم الأنسجة) / 1000 شمال شرقيتم تحويل مؤسسات التمويل الأصغر ومؤسسة التمويل الأصغر ر TC لعشرات من القطع بالمقارنة مع الفحص محددة لكل مستضد. الشكل 2. الممثل MFIA البيانات لاختبار الأمصال مع كل مفتش تسيطر عابرة. 12،4 MFIA تفسير يجب فقط نتائج الاختبار أن يفسر اللوحة إذا كان عنصر التحكم منظومة مراقبة ملاءمة والمصل (مفتش / الخرز المضادة للمفتش) نتائج تلبية معايير القبول الواردة في الجدول 2. يمكن فشل هذه الخرز التحكم اثنين مفتش تشير العديد من الأخطاء الإجرائية مثل التخفيف غير لائق أو غير كافية أو المتقارن حجم SPE، تخفيف اختبار المصل غير لائق أو استخدام المصل من حيوان immunocomprimised. الجدول 2 معايير القبول لضوابط الفحص السيطرة </td> النتيجة مقبولة نتيجة تصنيف ارتفاع متوسط ​​المناعي المصل ≥ 4،5 إيجابي انخفاض متوسط ​​المناعي المصل ≥ 1.5 ≥ الشريط الحدودي غير المصل المناعي <2.5 ≤ الشريط الحدودي مشعشع مخفف للزوجة <2.5 ≤ الشريط الحدودي تعيين IG حبة * ≥ Cutoff/1000 تجاوز * تعيين حبة المغلفة مع أنواع معينة مضادة للاختبار المصل المناعي (IG): فشل عشرات لهذه العينة السيطرة ملاءمة يمكن أن تنجم عن إضافة عينة كافية، عالية جدا في التخفيف العينة، والأنواع غير صحيحة أو مصل اختبار من هو العوز المناعيش. إذا كان أي من عناصر التحكم اختبار الفحص لوحة تفشل باستثناء مصل مجموعة عالية المناعي، والنتائج غير مقبولة ويجب أن تتكرر. تمرير منخفض عشرات مدى التحكم المصل حاسمة لأنه يدل على مستوى الحساسية الكشف عن لوحة الاختبار. يستند الماعز المضادة للمفتش حبة الأنواع نقاط على كمية من المصل الاختبار الأولية إضافة إلى الفحص. إذا كانت هذه السيطرة حبة فشل الجماعة الحكومية الدولية المختصة ولكن الأنواع يمر (حسنا B1، Fig.3) ثم يشير إلى أنه تم إضافة ما يكفي من التجارب الكواشف (BAG، SPE) لاختبار بشكل جيد وانها قضية المصل ذات الصلة. إذا كانت كمية غير كافية الكواشف اختبار خاص في كل من بئر ومفتش والخرز التحكم المضادة للمفتش تفشل (E1 حسنا، Fig.3). الشكل 3. نتائج اختبار الممثل MFIA مع الفشل (المشار إليها باللون البرتقالي). آبار A1، C1 F1 وتشير إلى وجود (رد الفعل الأنسجة) TC الفشلحيث يتم تمثيل نقاط TC بين قوسين. B1 الآبار وE1 توضيح هذين النوعين من الفشل مفتش الرقابة الداخلية، وعدم كفاية الاختبار الأجسام المضادة (B1) أو اختبار الكواشف (E1) BAG / SPE على التوالي. إذا اختبار نتائج الفحص لوحة تحكم مرضية، وتصنف درجات الفحص الفردية كما هو مبين في الجدول 3. فمن الأهمية بمكان أن تؤكد أي نتيجة إيجابية أو الشريط الحدودي من قبل طريقة الاختبار البديل. الجدول 3 MFIA نقاط التصنيف نتيجة تصنيف TC شبكة TC + * صافي ≥ 2 <0.5 <2.5 السالب (-) <td> ≥ 0.5 ≥ 2،5 TC التفاعل (T) <2 سلبي