<em> Drosophila</em> Yumurta oda mRNA lokalizasyon mekanizmaları eğitim için mükemmel bir modeldir. Lokalizasyon ve süreçlerini desteklemek dinamik olayları yakalamak için, canlı dokuda hızlı bir şekilde yüksek çözünürlüklü görüntüleme gereklidir. Burada, diseksiyon ve minimum kesinti ile canlı örnekleri görüntüleme için bir protokol mevcut.
Canlı hücre görüntüleme gibi eksen özellikleri, hücre farklılaşması ve organogenez 1 gibi konuları araştırmak için model olarak kullanılan Drosophila dokuların bir dizi uygulanan önemli bir tekniktir. Deney örneklerinin Doğru hazırlık çok önemli, ihmal, bir adımdır. Hazırlık amacı fizyolojik uygunluğu sağlamak ve optimal görüntüleme koşulları oluşturmaktır. Doku canlılığını korumak için, dehidratasyon, hipoksi, aşırı ısınma veya orta bozulma 2 önlemek için önemlidir.
Drosophila yumurta odası beden desenleme, mRNA lokalizasyon ve hücre iskeleti organizasyonu 3,4 ile sınırlı ilişkin soruları inceleyerek değil, iyi kurulmuş bir sistemdir. Erken ve orta dönem yumurta odaları için, halokarbon petrol montaj bu, oksijen serbest difüzyon sağlar dehidratasyon ve hipoksi önler ve mikroskopi için mükemmel optik özelliklere sahip olduğunu hayatta kalmak için iyidir. Imfloresan proteinlerin yaşlanma yumurta odası veya etiketli RNA, protein ya da 5-7 antikorların fiziksel enjeksiyon transgenlerin getirilmesi ile mümkündür. Örneğin, hayvanların genomuna MS2 yapıları Ayrıca yumurta 8'de mRNA'lar gerçek zamanlı gözlem sağlar. Bu yapıları da 9 kat protein ile MS2 bakteriyofaj RNA kök döngü etkileşim kullanımı yoluyla mRNA in vivo etiketleme için izin verir.
Burada, biz de dişi Drosophila tek tek ovaryolleri ve yumurta odaları izole olarak yumurtalıkların çıkarılması için bir protokol mevcut. Drosophila oogenez see Allan C. Spradling (1993, 2009 basıldı) 10 ayrıntılı bir açıklama için.
Canlı hücre görüntüleme gerçek zamanlı olarak hücresel süreçler incelenmesi için güçlü bir tahlil oluşturmaktadır. Basit parlak saha gözlem ek olarak, proteinler ve ilgi RNA'lar için flüoresan etiketlerin Ayrıca çok önemli gelişmeler yol açmıştır. Burada genetik ve biyokimyasal testler ile birlikte kullanılabilir görüntüleme bireysel yaşam oositler için bir protokol özetlediğim.
Bu protokol, biz de deneysel enjeksiyon yoluyla yaşam oosit işlemek için nasıl açıklayabilir. Doğrudan bir RNA Lokalizasyon (Ball ve Davis, yayınlanmamış) ve proteinlerin 6 işlevini inhibe antikorlar deneyi için ikincil bir yapının özelliği flüoresan etiketli RNA sentez in vitro dahil olmak üzere enjekte etmek için malzeme için pek çok olasılık, bulunmaktadır. Gelecekteki çalışmalar olasılıkla diğer etiketleme bileşenleri ve moleküler mekanizmaları test edilmesi sağlanarak yaşam oosit hücresel makine tanıtımı göreceksiniz.
t "> canlı hücreler çalışırken dokusunun canlılığını ve sağlık esastır. korunması bu protokol, biz yumurta odasının strese yol açabilecek bir dizi adım işaret. Örneğin, petrol görüntüleme için üstün olmasına rağmen, petrol genişletilmiş kültür yumurta odasında stres neden olabilir. Bu kolay (Figure7F için Şekil 7E (stressiz) karşılaştırmak (stres altında deforme ve bleb edecek nükleer morfoloji ve konumu, oosit zarı inceleyerek parlak alan maruziyeti altında izlenebilir )) vurguladı. Sahne 9 yumurta odaları RNA lokalizasyon ve çoklu saat boyunca sınır hücre migrasyonu 12 gösteriyor. Ancak, bir sahne 7/8 yumurta odasına kaldırılıyor over yaklaşık 40 dakika sonra halo karbonlu yağ kötü etkileri sergilemeye başlayacak kadın. Geç aşamada yumurta odaları, 14 sahne 11, çünkü bu aşamalar 13 folikül hücrelerinden yumurta kabuğu salgılanması yağı veya sulu ortam ya da normal gelişebilir. Bu repo oldusulu böcek orta insülin Ayrıca 6 saate 14 ve germaria kadar 14 saat 15 için sahne 9 oosit koruyabilirsiniz rted. Bu oosit vurguluyor ve canlılığı azaltır gibi tüm durumlarda, yumurta odasının agresif manevralar, kaçınılmalıdır. Görüntüleme yumurta odaları az ve tedavi etmek için özen her yavaşça optimum canlılığı sağlamak için en iyi yoldur.The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma I. Davis için bir Wellcome Trust Kıdemli Araştırma Bursu ile desteklenmiştir.
Tools used in dissection should be clean but do not need to be autoclaved. Wipe tools with ETOH and allow them to dry before beginning.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Fine tipped paint brush (Artists Sable, round, size 00 or 0) |
Available from most art supplies outlets | A good quality brush is important | |
Halocarbon Products Corporation, Series 95 | Halocarbon Products Corporation, 887 Kinderkamack Road, River Edge NJ 07661 | European distributor: Solvadis (GMBH) Be sure to oxygenate by bubbling air through the oil. |
|
Cover slip -No. 1.5, 22 x 50mm | International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm | Menzel-Glaser-22-40mm-MNJ 400-070T | |
Dumont No.5 – Dumostar | Fine Science Tools | 11253-20 | “Biologie” tip is also good but more fragile |
Dissecting probe | Fine Science Tools | 10140-01 | |
Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
CO2 pad | Available through http://www.flystuff.com/ (A division of Genesee Scientific) |
59-114 (789060 Dutscher) |
European distributor: Dutscher www.dutscherscientific.com/ It is also relatively easy to custom build your own fly pads |
KimCare | Kimbery Clark-KimCare-Medical wipes | KLEW3020 | |
Microscope- DeltaVision | Applied Precision | DC-CORE | |
Micromanipulator | Burleigh Micromanipulators from Lumen Dynamics Group inc. 2260 Argentia Road, Mississauga, Ontario, L5N 6H7 Canada |
Burleigh PCS-5000 series, TS-5000-300 | http://www.ldgi-burleigh.com/ (Formerly Exfo) |
Injection apparatus | Tritech Research, Inc. 2961 Veteran Ave Los Angeles, CA 90064 |
MINJ-1 | Modified with a holder to take Eppendorf Femptotips |
Injection needle | Eppendorf Sterile Femtotips I and II | 930000043 | Different tips are better for different applications |
Loading tips 20μl | Eppendorf | 5242956.003 | |
Dry active yeast | Fleischmann’s Yeast | #2192 |