Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescentie In situ Hybridisatie (LNA flow-FISH): een methode voor Bacteriële Kleine RNA-detectie

1. LNA sondes en experimenteel design Ontwerp LNA probes die in de omgekeerde complement van uw getranscribeerd Srna / mRNA of te laten maken op maat ontworpen op www.exiqon.com . Bij gebruik van de aangepaste ontwerp-optie, dan weet je de volgorde, maar niet de LNA spiking patroon. De toevoeging van elke LNA residu in een DNA-of RNA-oligonucleotide resulteert in een toename van de T m tussen de twee en 10 ° C voor een LNA-RNA hybridisatie duplex 14. Idealiter zou de ontworpen LNA sondes worden tussen 20-25 nucleotiden in lengte (langere probes zijn moeilijker te synthetiseren) en hebben een T m van tussen de 85-90 ° C voor RNA hybridisatie. Na het ontwerpen van de volgorde, gebruik BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi of vergelijk de probe-sequentie om uw lokale database om ervoor te zorgen de probe is specifiek alleen om uw Srna / mRNA van belang. Bij het bestellen van de LNA sonde, voeg een biotine-TEG wijziging aan het einde van de 5 'van het LNA oligonucleotide. De biotinylatie is nodig voor post-hybridisatie kleuring met een streptavidine-dye conjugaat. Het is mogelijk om deze wijziging toe te voegen aan het 3 'einde, indien nodig, maar de toevoeging aan het 5'-uiteinde is minder duur en moet resulteren in hogere opbrengsten. Drie negatieve controles dienen te worden opgenomen in de methode: (i) een 'no LNA' controle waarbij een LNA sonde niet wordt toegevoegd tijdens de hybridisatie stap, (ii) een 'no kleurstof' controle waarbij het LNA probe is gehybridiseerd met de doel Srna maar de hybridisatie evenement is niet te wijten aan de afwezigheid van de fluorescerende vlek ontdekt, en (iii) een 'niet-uitgedrukt Srna / mRNA' control dat een LNA sonde die een niet-bestaande of niet-uitgedrukt Srna om doelen gebruikt om niet-specifieke hybridisatie monitor. De specifieke LNA probe hier is complementair aan de Srna CsrB en heeft de sequentie 5'-biotine-TEG-gTccAttTccCgtCctTagCagC-3 '(LNA monomeren inhoofdletters). Na ontvangst van gevriesdroogde LNA, mengen met nuclease-vrij water tot 50 ug / ml en op te slaan in 10-20 pi porties bij -20 ° C. Oplossingen 8% paraformaldehye (PFA), 10% azijnzuur in PBS: Mix 1 ml 32% PFA, 400 uL azijnzuur, 400 ul 10X PBS, pH = 7,4, en 2,2 ml nuclease-vrij water. Voor bevroren monsters, bevriezen in voor eenmalig gebruik fracties bij -20 ° C zonder azijnzuur. 60% dextransulfaat oplossing: voeg 6,0 g dextraansulfaat om een ​​50 ml conische buis en water tot een eindvolume van 10 ml toe te voegen. Verwarm dit mengsel tot 65 ° C in een waterbad tot het dextraansulfaat is opgelost (kan 1-2 uur duren). Extra water moet mogelijk worden toegevoegd gedurende de solubilisatie proces om een ​​10 ml volume te behouden. Aliquot de 60% dextransulfaat-oplossing en bewaar bij -20 ° C tot gebruik. 2. Bevestiging Oogst 1×10 8 cellen van bioluminescente <em> Vibrio Campbellii of uw bacteriën van belang en dragen ze in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Deze hoeveelheid cellen geeft genoeg grondstof voor vier flow-FISH monsters (een specifieke LNA probe monster en drie negatieve controles). Extra 1,5 mL microcentrifugebuis fracties dienen te worden verzameld als andere Srna / mRNA soorten moeten worden getest. Pellet de bacteriële cellen door centrifugeren bij 2300 xg gedurende vijf minuten. Gooi het supernatant door pipetteren en resuspendeer de cellen in 400 pi van 1X PBS. Aan dit mengsel, voeg 400 ul van een 8% paraformaldehye (PFA) en 10% azijnzuur in 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (1X PBS)-oplossing, meng goed, en incubeer gedurende 10 minuten bij 25 ° C mengen een keer na vijf minuten. Alle incubaties, tenzij anders vermeld, worden uitgevoerd in een verwarmde buis houder. De PFA oplossing moet vers worden bereid of gebruikt van bevroren fracties na de toevoeging van azijnzuur. Paraformaldehyde is een verknoping fixatief dat helps naar cel morfologie behouden en te behouden intracellulaire RNA. Pellet van de cellen uit dit mengsel door centrifugeren bij 4500 xg gedurende twee minuten en verwijder het supernatant door pipetteren. Alle toekomstige stappen die centrifugeren vereisen, moeten gebruik maken van dezelfde instellingen (7K, 2 min). Het is belangrijk om dat na centrifugeren let op de bovenstaande vloeistoffen moeten worden verwijderd door pipetteren en niet decanteren. Twee keer wassen van de cellen met 400 pi 1X PBS en resuspendeer de laatste cel pellet in 400 pi 1X PBS. De cellen zijn nu vast en kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C in 400 ul 1X PBS tot zeven dagen. 3. Diethyl pyrocarbonate behandeling Bereid 400 ul van een 0,1% oplossing van diethyl pyrocarbonate (DEPC) in 1X PBS (400 pi van deze oplossing is noodzakelijk voor elke te testen monster, zodat schaal uit te voeren). De DEPC oplossing moet vers worden bereid uit een DEPC voorraad. DEPC behandeling inactiveert RNases door carbethoxylation en vermindert deachtergrond signaal. Voeg 400 pi van de 0,1% DEPC oplossing om ieder vast bacteriële cel monster en meng goed door pipetteren. Incubeer dit mengsel bij 25 ° C gedurende 12 minuten. Twee keer wassen van de cellen met 400 pi 1X PBS, pellet de cellen (7K, 2 min) en verwijder het supernatant. 4. Permeabilisatie Voeg 1,0 mg lysozym tot 1 ml Tris-EDTA-buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) voor een 1,0 mg / ml oplossing. Deze oplossing moet vers worden bereid. Voeg 800 ul van de 1 mg / ml lysozym-oplossing om de cellen, meng zorgvuldig door pipetteren en incubeer bij 25 ° C gedurende 30 minuten met af en toe mengen. Pellet de cellen (7K, 2 min) en verwijder het supernatant. Lysozym fungeert als een permeabilisatie reagens door het hydrolyseren de peptidoglycaan aanwezig is in bacteriële celwanden. Bereid een 3,0 pg / ml-oplossing van proteïnase K in TE-buffer. Deze oplossing moet vers worden bereid uit een 20 mg / ml proteïnase K voorraad die is opgeslagen bij -20 ° C.Proteinase K is een serine protease dat een verscheidenheid aan eiwitten verteert en helpt de toegankelijkheid van de sondes en reagentia aan het RNA. Voeg 800 ul van de 3,0 pg / ml proteinase K oplossing voor de cel-pellet en meng goed door pipetteren. Incubeer bij 25 ° C gedurende 15 minuten met vortexen halverwege de incubatie. Pellet de cellen (7K, 2 min), verwijder het supernatant en een keer was de cellen met 400 pi 1X PBS. Na het verwijderen van de was supernatant, resuspendeer de cellen in 400 microliter 1X PBS en voeg 100 ul van de resuspensie in vier nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buizen. Pellet de cellen (7K, 2 min) en verwijder het supernatant. 5. Hybridisatie Bereid 100 ul van hybridisatie buffer (HB) voor elk monster. De HB is gemaakt van 50% formamide in volume, 10% dextransulfaat massa (voeg 16,7 pi van de 60% dextransulfaat oplossing voor elke 100 pi), 1X Denhardt's oplossing, 50 mM natriumfosfaat pH 7,0,2X natriumcitraat (SSC), 20 ug van geschoren zalmsperma DNA (SSSD) en 20 ug gist tRNA. Elk van de onderdelen van het HB heeft een ander doel. Formamide verlaagt de smelttemperatuur van nucleïnezuur duplexen daarbij helpen met denaturatie van het RNA en het minimaliseren van celbeschadiging. Dextransulfaat wordt gebruikt als een volume-exclusief polymeer om de sonde te concentreren en de hybridisatie te verhogen. Denhardts oplossing, gist tRNA en SSSD dienen als een blokkerende middelen om niet-specifieke binding te verminderen. In elk van de cel resuspensie-bevattende 1,5 ml Reactievaatjes, voeg 95 uL HB en 5,0 pi van de Srna / mRNA-specifieke LNA [20 pmol van specifieke LNA eindconcentratie] of water (voor de niet LNA negatieve controle). Bijvoorbeeld: Tube 1 tot 95 pl HB + 5,0 pi Srna / mRNA-specifieke probe Tube 2 tot 95 pl HB + 5,0 pi Srna / mRNA-specifieke probe ('geen kleurstof' negatieve controle) Tube 3 tot 95 pl HB + 5,0 pi Srna/ MRNA sonde ('niet-uitgedrukt Srna / mRNA "negatieve controle) Tube 4 tot 95 pl HB + 5,0 pi water (negatieve controle 'geen LNA') Incubeer alle vier de monsters bij 60 ° C gedurende 60 minuten. De hybridisatie temperatuur hangt af van het LNA sonde (s) T m en moet worden vastgesteld op ongeveer 30 ° C lager dan de voorspelde T m voor RNA gloeien. Zowel de verhoogde temperatuur en hybridisatie formamide in de HB zorgt voor de denaturatie van de secundaire structuur van de Srna of mRNA van belang. 6. Post-hybridisatie wast Na hybridisatie, voeg 1,0 mL 0.1X SSC met 0,1% Tween-20 (SSCT) om de hybridisatie mengsel. Dit is nodig om de cellen te worden verwijderd uit de viskeuze hybridisatie-oplossing. Pellet de cellen (7K, 2 min) en verwijder het supernatant. Voeg 200 ul van 50% formamide, 2x SSC, 0,1% Tween-20 naar de cel pellets, meng zorgvuldig en incubaten gedurende 30 minuten bij 65 ° C in een verwarmings-blok. Voeg 1 mL 0.1X SSCT aan het mengsel, pellet de cellen (7K, 2 min) en verwijder het supernatant. Voeg 500 ui 0.1X SSCT om de cellen te resuspenderen en gedurende 40 minuten bij 65 ° C incuberen in een warmte-blok. Pellet de cellen (7K, 2 min) en verwijder het supernatant. 7. Blokkeren en vlekken Bereid de blokkerende buffer (BB) en het streptavidine-dye kleuroplossing. Bereid een 1X BB oplossing van een 5X voorraad (in de handel verkrijgbaar, zie reagentia). Voor elke set van vier buizen, voor te bereiden 1,2 ml 1X BB. Voeg 200 ul 1X BB naar de cel pellets, mengen en incubeer gedurende 30 minuten bij 25 ° C. Een streptavidine-geconjugeerde kleurstof wordt gebruikt om de gebiotinyleerde LNA sondes detecteren. Terwijl het blokkeren, een oplossing van 2 pg / mL DyLight 488 streptavidine of uw gewenste dye-streptavidine conjugaat in 1X BB gedurende 30 minuten (voor drie monsters, maken 300 pi). Na incubatie met 1X BB, pellet de cellen (7K, 2 min) en verwijder het supernatant. Voeg 50 ul van de streptavidine-kleurstof oplossing voor de cel pellets, meng zorgvuldig en voor 12 minuten bij 25 ° C incuberen met constant mengen op een vortex of in een Thermomixer. Voor de 'no kleurstof' controle, alleen maar 50 uL 1X blokkerende buffer. Voor de rest van het protocol, beschermen de buizen van licht met behulp van aluminiumfolie. Ze wast de cellen met 500 pL 0.1X SSCT buffer en een keer met 400 pi 1X PBS met 0,1% Tween-20 (PBST). Pellet de cellen (7K, 2 min) en verwijder het supernatant. Na de eerste streptavidine conjugaat-kleuring, wordt het signaal versterkt door de invoering van een gebiotinyleerd anti-streptavidine antilichaam aan het streptavidine-dye conjugaat en vervolgens vlekken een tweede keer met het streptavidine-kleurstof waardoor het signaal per gehybridiseerd LNA sonde (figuur 2) . Voeg 100 ul van 1 ug / ml gebiotinyleerd anti-streptavidine antilichaam in 1X PBS, resuspend de cellen, en incubeer bij 25 ° C gedurende 30 minuten met af en toe mengen. Pellet de cellen (7K, 2 min), verwijder het supernatant en was twee keer met 400 pi 1X PBST. Voeg 50 ul van de 2 ug / ml streptavidine-kleurstof oplossing voor de cellen, meng zorgvuldig en voor 12 minuten bij 25 ° C incuberen met constant mengen op een vortex of in een Thermomixer. Voor de 'no kleurstof' controle, alleen maar 50 uL 1X blokkerende buffer. Ze wast de cellen met 500 pL 0.1X SSCT buffer en een keer met 400 pi 1X PBST. Resuspendeer de cellen in 200 pi 1X PBST en bewaar bij 4 ° C tot klaar voor flowcytometrie-analyse. Voor kleinere bacteriële cellen die het debiet te vertragen tot de kern te verkleinen. Bovendien, voor flowcytometers met voorwaartse verstrooiing drempel cutoffs, moet de cutoff te stellen zo laag mogelijk te zorgen voor de kleine bacteriële cellen worden gedetecteerd. Voor DyLight 488 detectie, de flowcytometer worden uitgerust met een 488 nm laser en standaard emissiefactorenfilters voor FITC. Minstens 2×10 4 gebeurtenissen moeten worden verzameld. Voor compatibiliteit met flowcytometers uitgerust met verschillende lasers kunnen andere streptavidine-geconjugeerd fluoroforen gebruikt worden voor dit protocol. 8. Representatieve resultaten Een voorbeeld van cellen die zijn vast en effectief gepermeabiliseerd is te zien in de flowcytometrie dot plot in figuur 3A. Bij gebruik van de hierboven beschreven voorwaarden voor permeabilisatie, de cel populatie klein en homogeen met vermelding van enkele cel aggregaten. Wanneer hogere (5 mg / ml) concentraties van lysozym worden gebruikt, cellen hebben meer kans te aggregeren en tonen forward scatter verhoogde waarden, indicatief voor grotere deeltjes (Figuur 3B). Een voorbeeld van flow cytometrie gegevens van een succesvolle LNA flow-FISH experiment is weergegeven in Figuur 4. Het histogram toont de specifieke detectie van een doel Srna samen met drie negatieve controles.De 'geen kleurstof' negatieve controle geeft de minste fluorescentie, gevolgd door de 'nee LNA' en 'niet-uitgesproken Srna' negatieve controles. Tot slot, het monster met de Srna-specifieke probe LNA produceert de grootste fluorescentie. Zodra de methode en LNA sondes worden gevalideerd op deze manier, kunnen extra experimenten worden ontworpen om veranderingen in het Srna signaal te controleren in de tijd, in reactie op mutaties of gevarieerde cultuur, enz. Figuur 1. Schets van de algemene regeling van een LNA flow-FISH experiment voor de detectie van bacteriële Srna. Figuur 2. Kleuring en vermeerdering van het LNA flow-FISH signaal. a) Hybridisatie van de gebiotinyleerde LNA sonde. b) kleuring met de fluorescerende DyLight 488 streptavidine conjugaat. c) Binding van de gebiotinyleerde anti-streptavidin antilichaam aan de DyLight 488 streptavidine. Het antilichaam kan binden streptavidine door zijn antigeen-bindingsplaats of kan worden gebonden aan streptavidine via haar biotine residuen. d) Versterking van het signaal door verdere kleuring met de fluorescerende DyLight 488 streptavidine conjugaat. Figuur 3. Flowcytometrie dot plots naar voren laten zien ten opzichte van zijwaartse verstrooiing resultaten voor a) 1 mg / ml lysozym, 3 pg / ml proteinase K permeabilisatie en b) 5 mg / ml lysozym, 3 ug / ml proteinase K permeabilisatie. Figuur 4. Histogram analyse van de LNA flow-FISH resultaten. Het fluorescerende signaal gegenereerd uit elk monster wordt weergegeven door de vier sporen: zwart – Srna-specifieke LNA probe; rood – negatieve controle 'niet-uitgesproken Srna'; blue – negatieve controle 'nee LNA'; paars -Negatieve controle 'geen kleurstof'.