锁核酸流式细胞仪，荧光原位杂交（LNA流FISH）：细菌小RNA检测方法

1。 LNA的探测和实验设计设计的LNA探针，是您的转录斯尔纳/ mRNA的反向补充或他们的自定义设计 www.exiqon.com 。如果使用自定义的设计选项，你会知道的顺序，但不低噪声放大器（LNA）扣球模式。此外，在增加的T 之间米到每个LNA残留的DNA或RNA寡核苷酸结果两个10 ° C的低噪声放大器- RNA杂交双工 14 。理想的情况下，设计低噪声放大器（LNA）探头应20-25个核苷酸（较长的探头更难以合成） 之间的85-90之间的Tm ° C的RNA的杂交。 设计序列后，利用高炉http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi或探针序列比较本地数据库，以确保探头是只对特定的斯尔纳/ mRNA的利益。 订货时的LNA探针，LNA的寡核苷酸的5'端添加生物素甘醇修改。生物素是杂交后用链霉亲和染料共轭染色所需。它可以添加此修改的3'端，如果有必要，但另外的5'端更便宜，并应导致更高的收益率。 应包括三个阴性对照的方法：（一）“无LNA的控制，在其中LNA探头没有添加在杂交步骤，（二）”无染“控制的LNA探针杂交目标斯尔纳但杂交事件是没有检测到荧光染色的情况下，（三）“非表示斯尔纳/，表达”的控制，采用了低噪声放大器探头的目标是为了不存在或不表达斯尔纳监控非特异性杂交​​。 具体LNA探针这里是相辅相成的斯尔纳CsrB和序列5' -生物素- TEG – gTccAttTccCgtCctTagCagC – 3'（LNA的单体大写字母）。 在收到冻干低噪声放大器，在10-20微升等分无核酸酶水悬浮在-20 ° C至50微克/毫升和存储解决方案 paraformaldehye 8％，10％的乙酸在PBS（PFA）：混合1 mL 32％的煤灰，400μL乙酸，400μL10X PBS，pH = 7.4的，2.2毫升无核酸酶水。对于冻结等分，冻结在-20 ° C情况下使用醋酸等分单。 60％的硫酸葡聚糖溶液：添加6.0克硫酸葡聚糖50 mL锥形管，并加水至终体积10毫升。这种混合物加热至65 ° C水浴中溶解，直到硫酸葡聚糖（可能需要1-2小时）。的增溶过程中保持10毫升量增加，可能需要更多的水。分装在60％硫酸葡聚糖解决方案，并在-20 ° C储存，直到使用。 2。固定收获1 × 10 8个细胞的生物发光<em弧菌campbellii或您感兴趣的细菌和他们转移到1.5 ml离心管。这种细胞的数量，提供足够的起始原料，四流的鱼类样品（一个特定的LNA探针样品和3个阴性对照）。应收集额外的1.5 ml离心管分装，如果需要进行测试，其他斯尔纳/ mRNA的物种。 球离心五分钟在2300 XG的细菌细胞。倒掉上清，吹打在400μL1 × PBS重悬细胞。 这种混合物，添加400μLparaformaldehye 8％（PFA）和1X磷酸10％的醋酸缓冲液（1X PBS）的解决方案，拌匀，并孵育10分钟，在25 °彗星搅拌一次五分钟后。在加热管的持有人，除非另有说明，所有孵化执行。的煤灰的解决方案应准备新鲜或冷冻分装后用醋酸此外。多聚甲醛是一种交联固色剂的H电子学习产品，以维持细胞的形态和保留细胞内的RNA。 离心沉淀细胞从这种混合物在4500 XG两分钟，吹打除去上清液。所有需要离心未来步骤应该使用相同的设置（7K，2分钟）。重要的是要注意以下的离心上清应吹打，而不是调迁。 两次用400μL1 × PBS清洗细胞和悬浮在400μL1 × PBS最后的细胞沉淀。现在，这些细胞是固定的，并可以保存在4 ° C在400μL1 × PBS为七天。 3。焦碳酸二乙酯处理准备400μL1X PBS（400μL该解决方案需要为每个样品进行测试，以便规模相应）0.1％的焦碳酸二乙酯（DEPC）解决方案。从残留的DEPC股票应准备新鲜的DEPC处理的解决方案。 DEPC处理可灭活carbethoxylation核糖核酸酶和减少背景信号。 加入400μL0.1％DEPC解决每一个固定的细菌细胞样本，并拌匀吹打。这种混合物在25 ° C孵育12分钟。清洗细胞两次与400μL1 × PBS，颗粒细胞（7K，2分钟），去除上清。 4。通透溶菌酶添加1.0毫克，1.0 mg / mL的溶液1毫升的Tris – EDTA缓冲液（10毫米的Tris，1 mM的EDTA，pH值8.0）。该解决方案应准备新鲜。添加800μL1 mg / mL的溶菌酶溶液的细胞，调匀吹打，并培育25 ° C时30分钟，偶尔搅拌。沉淀细胞（7K，2分钟），去除上清。溶菌酶行为水解细菌细胞壁的肽聚糖目前作为一个通透试剂。 准备在TE缓冲液中的蛋白酶K 3.0微克/ mL的溶液。从20 mg / mL的蛋白酶K的股票是储存在-20 ° C，这一解决方案应准备新鲜蛋白酶K是一种丝氨酸蛋白酶，消化各种蛋白质，并有助于的RNA的探针和试剂的可访问性。 加入800μL的3.0微克/ mL蛋白酶K溶液细胞沉淀，调匀吹打。在25 ° C孵育15分钟，中途通过孵化与涡旋。 颗粒细胞（7K，2分钟），取出上清液，用400μL1 × PBS洗细胞一次。取出后洗净上清，400μL1 × PBS重悬细胞，并添加到四个新的1.5 ml离心管100μL的再悬浮。沉淀细胞（7K，2分钟），去除上清。 5。杂交准备每个样品100μL杂交缓冲液（HB）。高亮度的50％甲酰胺，按量，按重量的10％右旋糖酐硫酸（添加16.7μL的60％硫酸葡聚糖溶液，每100μL，），1X登哈特的解决方案，50 mM磷酸钠pH值7.0，2X柠檬酸钠（SSC），20微克剪切鲑鱼精子DNA（SSSD）和20微克酵母tRNA。 高亮度的组成部分，每个人都有不同的目的。甲酰胺降低核酸，从而帮助双链RNA的变性和减少细胞损伤的熔融温度。硫酸葡聚糖是作为一个体积不包括聚合物集中探头和提高杂交率。 Denhardts解决方案，酵母tRNA和SSSD作为一个阻断剂，以减少非特异性结合。 再悬浮含1.5毫升离心管，在每个细胞中添加95μLHB和5.0斯尔纳/μL，表达特定的LNA或水（没有LNA的阴性对照）[20 pmol具体LNA终浓度]。例如： 管1 – 95μL，HB + 5.0μL，斯尔纳/ mRNA的特异性探针管2 – 95μLHB + 5.0μL，斯尔纳/ mRNA的特异性探针（“不染”阴性对照） 管3 – 95μL，HB + 5.0μL，斯尔纳/基因探针（“非表示斯尔纳/ mRNA的阴性对照） 管4 – 95μL，HB + 5.0μL水（“没有LNA的”阴性对照） 所有四个样品在60℃孵育60分钟。杂交温度取决于LNA的探针（S） 的 Tm，并应设置约30 ° C以下，预测的RNA退火米T为。高架杂交温度，并在HB甲酰胺确保斯尔纳或利益的mRNA的二级结构变性。 6。后杂交洗杂交后，添加0.1％吐温20（SSCT）1.0毫升0.1X SSC杂交混合物。这是必要的，允许粘性杂交液中取出的细胞从。沉淀细胞（7K，2分钟），去除上清。 加入200μL50％甲酰胺，2X SSC，0.1％Tween – 20的细胞沉淀，调匀和incub30分钟吃65 ° C的加热块。 加入1 ml 0.1X SSCT的混合物，颗粒细胞（7K，2分钟），去除上清。 加入500μl的0.1X SSCT悬浮细胞和一个加热块40分钟，65℃孵育。沉淀细胞（7K，2分钟），去除上清。 7。阻塞和染色准备封闭液（BB）和链霉菌染色解决方案。从5倍的股票（市售，见试剂），准备一个1X BB的解决方案。对于每四个管子，准备1.2毫升1X BB。 加入200μl1X的BB，重悬细胞沉淀，孵育30分钟，25 ° C。 一个链霉亲和共轭染料是用来检测的生物素标记的低噪声放大器（LNA）探针。同时阻止，准备2微克/毫升DyLight 488链霉亲和素或1X为30分钟（三个样品，使300μL）BB共轭染料 – 亲你想要的解决方案。 后incubATION与1X BB，颗粒细胞（7K，2分钟），去除上清。加入50μL的链霉亲和染液细胞沉淀，调匀，孵育12分钟，25 ° C恒定混合旋涡，或在thermomixer。 “不染”的控制，只添加50μL的1X封闭液。对于其余的协议，保护使用铝箔的光管。 用500μl的0.1X SSCT缓冲洗细胞一次，一次400μL1X PBS 0.1％吐温20（PBST）。沉淀细胞（7K，2分钟），去除上清。 继最初的链霉亲和共轭染色，信号被放大，引入生物素标记的抗链霉亲和抗体的链霉亲和染料的共轭，然后染色与链霉亲和染料从而增加每LNA的探针杂交信号输出（图2）第二次。 加入100μL1微克/毫升的生物素化的抗 – 亲和抗体1X PBS，resuspend的细胞，孵育在25℃30分钟，偶尔搅拌彗星。颗粒细胞（7K，2分钟），取出上清液400μL1X PBST洗两次。 加入50μL的2微克/毫升链霉菌细胞染液，调匀，孵育12分钟，25 °恒定混合旋涡，或在thermomixer C。 “不染”的控制，只添加50μL的1X封闭液。 清洗细胞一次用500μl的0.1X SSCT缓冲区，一旦与400μL1X PBST。 细胞重悬于200μL1X PBST和储存于4 ° C，直到准备流式细胞仪分析。对于规模较小的细菌细胞集流速缓慢下降的核心大小。此外，与前向散射阈值截断流式细胞仪，截止必须尽可能低，以确保小细菌细胞检测。 DyLight 488检测，流式细胞仪应配备一个488 nm激光和标准排放过滤为FITC标记。应收集事件至少2X10 4。与流式细胞仪配备不同的激光器兼容，其他的链霉亲和共轭荧光团可用于本议定书。 8。代表性的成果例如，有效固定和通透的细胞在流式细胞仪散点图图 3A所示。使用通透描述了上述条件时，细胞的人口是小和同质表明一些细胞聚集。当溶菌酶浓度较高（5毫克/毫升）的使用，细胞更容易聚集并显示增加向前的分散值，表明较大的颗粒（ 图3B） 。流式细胞仪从一个成功的LNA流FISH实验数据的一个例子是如图4所示。直方图表明，随着三个阴性对照的具体目标斯尔纳检测。“不染”阴性对照，产生最少的荧光，“没有低噪声放大器”和“非表示斯尔纳阴性对照。最后，特定SRNA – LNA探针与样品产生最大的荧光。一旦以这种方式进行验证，方法和LNA探针，可以进行更多的试验旨在监视斯尔纳信号的变化，随着时间的推移，在应对突变或不同的文化条件等 图1描绘了一个LNA流鱼的细菌斯尔纳检测试验总体方案。 图2。染色和LNA的流动FISH信号放大。 A）生物素化的LNA探针杂交。 B）染色与荧光DyLight 488链霉亲和共轭。 C）的生物素化抗- S绑定treptavidin抗体DyLight 488链霉。抗体可以通过其抗原结合位点结合的链亲和素或可通过其生物素残留链霉亲和约束。 D）进一步荧光DyLight 488链霉亲和共轭染色的信号放大。 图3流式细胞仪检测点图显示侧散射结果与A）1 mg / mL的溶菌酶，3微克/ mL的蛋白酶K通透和B）5毫克/毫升溶菌酶，3μg/ ml的蛋白酶K通透。 图4。直方图分析LNA流FISH结果。从每个样品产生的荧光信号是由四个痕迹所示：黑色 – 具体SRNA – LNA探针;红色 – “非表示斯尔纳”阴性对照;蓝色 – “没有LNA的”阴性对照;紫色 -“不染阴性对照。