Denne video protokol viser isolation og udvidelse af stamceller lignende celler fra kirurgisk resektion menneskelige glioblastom mutliforme (GBM) tumor væv ved hjælp af neurosphere assay kultur metode.
Stem-lignende celler har været isoleret i tumorer såsom bryst-, lunge-, tyktarms-, prostata og hjerne. Et kritisk punkt i alle disse tumorer, især i glioblastom mutliforme (GBM), er at identificere og isolere tumorfremkaldende cellepopulation (r) til at undersøge deres rolle i tumordannelse, progression, og gentagelse. Forståelse tumorfremkaldende cellepopulationer vil give et fingerpeg om at finde effektive behandlingsmetoder for disse tumorer. Den neurosphere assay (NSA) på grund af sin enkelhed og reproducerbarhed er blevet brugt som den foretrukne metode til isolering og opformering af mange af denne tumorceller. Denne protokol viser neurosphere kultur metode til at isolere og udvide stamceller-lignende celler i kirurgisk resektion menneskelige GBM tumor væv. Procedurerne omfatter en indledende kemisk fordøjelse og mekanisk dissociation af tumorvæv, og efterfølgende plettering den resulterende enkelt celle suspension i NSA kultur. Efter 7-10 dage, neurospheres primære af 150-200 ìm i diameter kan observeres og er klar til yderligere passaging og ekspansion.
At isolere neurale stamceller og stamceller fra normale voksne og føtale hjerner 1, 2, 3, 4 og også tumor stamceller-lignende celler fra kræft væv såsom lunger 5, prostata-6, bryst 7 og hjerne 8, 9, neurosphere analysen er blevet ofte bruges som den foretrukne metode. Ved hjælp af denne enkle og reproducerbare analyse, kan man generere et ubegrænset antal af celler fra resektion af tumorvæv, der viser samme karakteristika som somatiske stamceller; ex vivo multipotency, evnen til at skabe nye svulster på implantation, og selv-fornyelse. Disse celler kan bruges til at studere de grundlæggende kræft cellebiologi herunder celle-til-celle-interaktioner og differentiering, migration, invasion og celledød. Derudover giver isoleret tumor stamceller-lignende celler et uvurderligt værktøj til at studere, hvordan tumorer form, fremskridt og tilbagefald og også for at optrævle de underliggende følger cellulære mekanismer, der i sidste ende kan give indsigt til terapeutiskvalgmuligheder.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Florida Center for Brain Tumor Forskning; Preston A. Wells Jr. Center for Brain Tumor Therapy.
Name of the reagent | Type | Company | Catalogue number | Comments |
NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Medium | Stem Cell Technologies | 05750 | |
NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05753 | |
%0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
*MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
*HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
*Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
**DNase I | Reagent | Roche | 104159 | |
**Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
No. 10 scalpel blade | Surgical tool | BD | 371610 | |
Petri Dish | Culture ware | BD Falcon | 353003 | |
Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050-10 | |
Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
* To make HEM, mix 1x10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
** To prepare trypsin inhibitor solution, first make 10 ml of DNase I solution (100 mg DNase dissolved in 100 ml of HEM) and then add 0.14 g of trypsin inhibitor to DNase solution and finally make the volume up to 1 Liter using HEM. Keep aliquots of the final products in -20°C freezer.