En électroporation in vivo de morpholinos dans la régénération des adultes Zebrafish Tail Fin

1. Resuspendre morpholino Diluer 300 nM de fluorescéine-étiqueté morpholino dans 100 ul de nucléase-free eau pour faire une solution d'environ 3 mm. La solution est répartie dans des morpholino plusieurs microtubes paraffine scellés et entreposés à température ambiante et loin de la lumière. Pour déterminer la concentration exacte morpholino, diluer 5 pi de solution de morpholino (ou de l'eau comme une vierge) dans 95 ul de 0,1 N HCl. Fixer une référence sur un spectrophotomètre à 265 nm avec le blanc de l'eau et de déterminer ensuite la lecture de la solution diluée morpholino. Multiplier l'absorbance morpholino par sa constante déterminée et par le facteur de dilution pour déterminer la concentration en ng / ul. La constante est morpholino calculé comme suit: Morpholino constante = poids moléculaire de l'absorbance X morpholino 1000/molar. Le poids moléculaire et l'absorbance molaire pour le morpholino peuvent être trouvées sur le "Oligo Properties "feuille fournie avec le produit. Diviser la concentration morpholino, en ng / ul, par le poids moléculaire pour déterminer la concentration en mM. Diluer le morpholino, si nécessaire, à une concentration de travail, généralement 1,2 mM. 2. Amputation de la nageoire Anesthésier poisson zèbre adulte soit tricaïne ou 2-phénoxyéthanol à 1,0 mg / ml dans l'eau du réservoir. L'amputation de la nageoire à l'aide d'une lame de rasoir ou un scalpel stérile proximale du premier point de branchement lepidotrichial. Cela devrait être fait à la même proximale / distale emplacement sur chaque animal (par exemple 7 segments osseux distaux de la ceinture fin). IMPORTANT: assurez-vous de couper parfaitement perpendiculaire au plan antérieur / postérieure de l'animal. Coupes en biais se traduira dans l'expansion de la nageoire inégale des moitiés dorsale et ventrale de la nageoire. Retournez le poisson dans un réservoir. En général, nous maintenir le poisson à 33 ° C pour augmenter le taux de régénération. Selon la conception expérimentale, wACI 0-2 jours après l'amputation (dpa) pour la régénération des nageoires et commencer avant l'introduction de la morpholino. D'autres approches sont abordées dans la discussion, ci-dessous. 3. Morpholino injection Le jour avant l'injection du morpholino, faire une plaque d'injection (figure 2). Assurez-vous de découper une encoche à une extrémité du puits, qui aide à stabiliser le poisson pour la procédure de microinjection. A 2 dpa, préparer l'appareil d'injection de micro-et la solution morpholino. Diluer la fluorescéine-étiqueté morpholino à la concentration appropriée (vous recommandons de commencer avec 1,2 mM) et placer dans un bain à 65 ° C l'eau, pendant 5 minutes. Retirez l'aiguille de verre pour l'injection de micro-aiguilles aide d'un extracteur. Chargez l'aiguille avec le morpholino (note: selon que vous sauvegardez le remplissage ou l'avant-charger votre aiguille de déterminer si vous chargez la première aiguille, ou de couper la pointe en premier). Coupez la pointe de l'aiguille à uneangle n. Suivez les instructions de votre système d'injection de micro-injecter une bulle d'environ 5 nl de morpholino par injection. Les volumes plus importants de morpholino pourrait perturber le tissu. Anesthésier le poisson et les déposer sur la plaque d'injection. Retirez tous les excès de liquide et d'orienter l'aiguille à l'emplacement approprié, juste en aval de la raie osseuse (figure 3). En utilisant un microscope et un appareil approprié pour la micro-injection morpholino injections (voir le tableau des réactifs spécifiques), injecter le morpholino dans la nageoire d'avant en arrière, comme le montre la figure 3. L'injection d'arrière en avant provoque le tissu fin de retrousser lors de l'injection et il est très difficile. Insérez l'aiguille doucement dans le tissu régénératrice, juste en aval de chaque rayon osseux (marqué "1" dans la figure 3) et poussez jusqu'à ce que distalement situé dans le blastème (marqué «2» à la figure 3). Soyez prudent de ne pas pousser l'aiguille à travers la sallefin des pneus. Lorsque l'aiguille est correctement localisée, injecter le morpholino (c.-à-cliquer une fois). A 1,2 mM, la solution de fluorescéine-étiqueté morpholino apparaît jaune-vert, même dans des conditions d'éclairage normales. Avec chaque injection, d'un jaune "bouffée" de la solution morpholino peuvent être visualisées, ce qui permet de localiser l'injection pour le blastème. Environ 75 nl (10-15 clics) de la solution morpholino doit être injecté par rayon osseux. Pause ~ 1 sec entre les deux clics. Nous injecter seulement la face dorsale, en utilisant la ventrale électroporation seule commande. Alternativement, on pourrait répéter cette procédure complète en utilisant un morpholino contrôle sur la moitié ventrale de la nageoire. 4. L'électroporation de la morpholino Immédiatement après l'injection du morpholino, retirer la plaque d'injection de l'appareil d'injection de micro-. Remplir la plaque d'injection bien avec la solution d'anesthésie jusqu'à ce que le poisson est immergé. L'électroporation est réalisée sous la conduite d'eau. <p> A platine 3 mm de diamètre pince plaque d'électrode (CUY-P3 650 pincettes, Protech international) localise les impulsions d'environ la moitié de l'ailette. Soyez prudent de ne pas toucher les électrodes sur le tissu fin. Pour veiller à ce que les électrodes ne se touchent pas le tissu fin, tourner le poisson sur sa face dorsale et regardez vers le bas de la ligne médiane pour l'électroporation. Électroporer la fois la dorsale et ventrale (pour contrôler les effets d'une électroporation non-spécifiques) côtés de la nageoire en utilisant une onde carrée CUY21 Electroporateur (Protech International, Inc). Essuyez les électrodes avec une Kimwipe humide après chaque électroporation pour éliminer les bulles qui se sont formées. Si elles ne sont pas supprimés, un mini-charge s'accumule, ce qui va attirer le tissu vers l'électrode. Les paramètres d'électroporation devrait être fixé à dix consécutive impulsions de 50 ms, à 15 V avec une pause de 1 sec entre les impulsions. Placer le poisson sur une lame de verre ou de boîtes de Pétri et rapidement l'image de la fin, en veillant à nouvoir l'orientation dorsale / ventrale. Cette image sera utilisée pour l'analyse repousse le lendemain. Retournez le poisson dans le réservoir. 5. Analyse Si la protéine ciblée qui a été renversé dans l'expression est nécessaire à la régénération fin bon, une différence spectaculaire entre les deux moitiés dorsale et ventrale de la nageoire devrait être évident un jour après l'électroporation (figure 5B). A 3 dpa, prendre une autre photo de la nageoire de chaque poisson et correspondre cette image avec le correspondant d'image 2 dpa (figure 5B). La variation naturelle dans le modèle de pigmentation fin entre les animaux vous permettra d'identifier correctement chaque poisson. Utilisation de l'image NIH, de retracer les 2 et 3 dpa zones dpa des deux moitiés des dorsales et ventrales (figure 5B). Pour déterminer la zone% de la consommation par rapport dorsale ventrale de la formule suivante: (dorsaux 3DPA – dorsaux 2dpa) / (ventrale 3DPA – 2dpa ventrale) X 100 =% de la surface 6. Les résultats représentatifs Nous avons toujours de dosage pour l'excroissance fin à 3 hpe dpa, ou 24 (électroporation heures après). A cette époque, le morpholino fluorescéine-étiqueté doivent être présents dans la moitié dorsale de la nageoire (Figure complémentaire 1 et la figure 6A). Il est normal de voir certains de fuite vers le bas pour le niveau de l'amputation. Il devrait y avoir aucune différence entre les côtés dorsal et ventral de la nageoire injecté et électroporation avec le morpholinos de contrôle (figure 6B). Si la cible expérimentale morpholino une protéine essentielle pour leur croissance nageoire, une différence considérable entre les côtés dorsal et ventral doivent être observées (Figure 6C). Si l'électrode a touché l'aileron lors de l'électroporation, le tissu apparaît brune (presque brûlé en apparence) et nécrotiques. "Src =" / files/ftp_upload/3632/3632fig1.jpg "/> Figure 1. Schéma des différents événements qui se produisent lors de la régénération fin. Les temps qui sous-tendent pour chaque événement sont donnés en heures post-amputation (hpa) et correspondent à une température de la cuve de 33 ° C. Figure 2. A. Schéma de la plaque d'injection, qui est fabriqué à partir d'agarose et contient un petit puits pour maintenir le poisson pendant micro-injection du morpholino. Figure 3. Schéma de microinjection morpholino. A. Placez le poisson dans le plat avec la tête du poisson dans l'encoche découpée dans le puits, ce qui aidera les poissons restent stables. B. A faible grossissement, organiser l'aiguille de telle sorte que il est à proximité de la régénération des tissus de l'ailette. C </stro> ng A plus fort grossissement, injecter la partie distale de chaque rayon de la nageoire osseuse (à savoir dans chaque blastème) morpholino. L'aiguille doit entrer dans le tissu juste en aval de l'rayons osseux (1), puis continuer à l'emplacement du blastème (2). Remarque: les cercles verts dans le schéma sont uniquement destinées à indiquer l'emplacement de l'injection. Le morpholino peut brièvement être visualisé comme un vert / jaune "bouffée" après chaque injection, mais cela ne persiste pas comme indiqué dans le schéma. Figure 4. Schéma d'électroporation fin. A. Après microinjection, placer le poisson dans une boîte de Pétri pleine de l'anesthésie et électroporer les moitiés dorsale et ventrale. B. Assurez-vous de ne pas toucher le tissu fin. Les électrodes doivent être placés ~ 1 mm à partir du tissu. <strong> Figure 5. Schéma des méthodes utilisées pour calculer l'inhibition excroissance fin. A. Prendre une photo de la nageoire de chaque poisson à 2 dpa, soit immédiatement avant ou après l'injection morpholino et l'électroporation. Trace le tissu régénératrice à la fois de la dorsale (vert) et ventrale (bleu) moitiés de la nageoire en utilisant NIH Image, (lignes noires en pointillés). B. A 3 dpa, prendre une autre photo de chaque ailette et de nouveau tracer les zones dorsale et ventrale de la repousse à l'aide d'image NIH. C. Soustrayez le domaine de la repousse à 2 dpa de la repousse totale de 3 dpa, tant pour les nantis dorsales et ventrales. La zone dorsale pour cent des contre ventrale repousse peut être calculé selon la formule: ((D 3DPA – D 2 dpa) / (V 3DPA – V 2dpa)) X 100. = 100 pour cent d'inhibition – Pourcentage de la superficie. Exemples Figure 6. De s'attendrerésultats. A. image fluorescente montrant une fluorescéine-étiqueté de contrôle morpholino dans la moitié dorsale de la nageoire, 24 heures après l'électroporation-(HPE). B. Brightfield l'image d'un aileron qui a été injecté et électroporation avec un morpholino de contrôle dans la moitié dorsale . L'image montre la repousse égale des deux moitiés des dorsales et ventrales d'une nageoire, 24 hpe. C. Brightfield l'image d'un aileron qui a été injecté et électroporation avec un morpholino expérimentale dans la moitié dorsale. L'image montre l'inhibition de la repousse sur le côté dorsal / injecté. La ligne indique le montant de la repousse à 2 dpa, immédiatement avant l'injection morpholino et l'électroporation. Figure 7. Schéma d'une injection alternée et la procédure d'électroporation à des protéines cibles impliquées dans la cicatrisation des plaies et la formation de blastème. A. Injecter le morpholinoentre chaque rayon de la nageoire osseuse sur la moitié dorsale de la nageoire. B. électroporer la morpholino comme d'habitude. C. amputer la nageoire immédiatement proximale (~ 1 segment osseux) au site d'injection. D. La fluorescéine-étiqueté morpholino peuvent être observées dans l'épithélium de la plaie et blastème à 24 hpe. Figure 8. En utilisant la technique de cibler l'épithélium plaies et la formation blastème. A. Brightfield l'image d'une ailette à 24 hpa qui a été injecté et électroporation avec un morpholino, immédiatement avant l'amputation. B. image fluorescente de la nageoire montré dans le panneau A. Note que la moitié injectée dorsale de la nageoire montre bonne assimilation du morpholino dans le tissu régénératrice. C -. C "plus fort grossissement de la moitié dorsale de la nageoire présenté dans les panneaux A et B. Les sites d'injection sont souvent encore visibles (flèches), Mais de nombreuses cellules cibles ont migré à participer dans l'épithélium de la plaie et la formation blastème (flèche). Figure 9. En utilisant la technique pour cibler les cellules qui migrent pour former le blastème. A. fluorescent et les images en fond clair encart montrant une nageoire injecté et une électroporation avec morpholino sur les deux moitiés des dorsales et ventrales. La nageoire a ensuite été amputée à deux plans. La moitié dorsale a été coupé immédiatement en aval des sites d'injection, alors que la moitié ventrale a été coupé 9-10 segments osseux distaux aux sites d'injection. B. A 24 hpa, les images fluorescentes et fond clair encart montrent que morpholino a migré vers la dorsale régénérer (1), mais pas les régénérés ventrale (2), indiquant que seule la cellule immédiatement à proximité du site de coupe participer à la formation de blastème. Les deux ensembles de pointes de flèches blanches montrent le niveau de chaque amputationavion. Panneaux marqués 1 et 2 à l'extrême droite de l'image montrent une vue plus fort grossissement des moitiés dorsale et ventrale de la nageoire, respectivement. Figure 1 supplémentaire. Une vidéo d'un confocale z-empilement d'une région correspondant à l'emplacement d'un blastème dans une ailette injecté et une électroporation avec un groupe morpholino commande. L'image a été prise à 24 hpe. Comme une molécule de fluorescéine unique ne peut pas être visualisée, pas tous de la morpholino peuvent être visualisés ou quantifié. Cependant, ces images donnent une idée des divers degrés de l'absorption qui peuvent être visualisées dans des cellules individuelles, à partir de points punctiformes, à cellules entières pleines de fluorescence morpholino. Sur l'image fixe, l'orientation est indiquée. La barre d'échelle: 25 microns.