再生的成年斑马鱼尾鳍在吗啉代入体内电穿孔

1。重悬吗啉到100μL无核酸酶水稀释300纳米荧光标记啉，使约3毫米的解决方案。吗啉溶液分装成多个石蜡密封离心管中，并在室温和避光储存。 以确定确切的吗啉浓度，稀释在95μL的0.1 N的盐酸吗啉溶液5μL（或水）作为空白。设置上与水的空白，在265 nm的分光光度计基线，然后确定稀释的吗啉溶液的读数。待定常数乘以稀释倍数啉吸收，以确定在ng /μl的浓度。啉常数的计算公式为： 吗啉常数=啉X 1000/molar吸收的分子量。 吗啉的分子量和摩尔吸光可以发现“寡属性“表提供的产品。除以啉浓度，ng /μl的分子量确定以毫米为单位的浓度，稀释吗啉，如有必要，工作浓度，一般为1.2毫米。 2。鳍截肢麻醉成年斑马鱼在，要么Tricaine或2 – 苯氧乙醇在1.0毫克/毫升水箱。 使用无菌手术刀或刀片第一lepidotrichial分支点近端截肢的鳍。这项工作应在相同的近端/远端对每个动物的位置（例如7鳍腰带从远端的骨段）。要点：确保削减完美动物的前/后平面垂直。角度的削减将导致不平衡鳍的鳍背，腹部分生长。 鱼坦克。我们通常鱼保持在33°C到提高再生率。根据实验设计，WAIT 0-2天截肢后翅再生（DPA）开始前引进的吗啉。替代方法在下面的讨论，讨论。 3。吗啉注射液前一天注射吗啉，使注塑板（ 图2）。确保切出一个缺口，在一端的好，这有助于稳定的显微注射过程中的鱼。 2 DPA，准备微注射器具及吗啉的解决方案。 稀释的荧光标记啉适当浓度（推荐1.2毫米起）和地方在65℃水浴5分钟。 使用微量注射一针拔拉玻璃针。 加载啉针（注：无论你回来填充或前加载你的针，将决定你是否加载第一针，或削减尖端而定）。 在削减了针的尖端ñ角。 按照您的微喷射系统的方向，注入约5 NL啉的泡沫，每次注射。啉量较大，可能会破坏组织。 麻醉注射板鱼和地方。删除所有多余的液体和东方的针到适当的位置，只是远端骨线（ 图3）。使用显微镜和显微注射仪适合吗啉注射液（见表的特定试剂），由前至后翅注入吗啉， 如图3所示。从后至前注射会导致鳍组织在注射推出，是非常困难的。 针轻轻插入到再生的组织，只是远端每个骨射线（标有“1”，在图3）和远端推，直到位于胚（标有“2”，在图3）。要小心，不要推针通过EN轮胎的鳍。当针正确定位，注入吗啉（即点击一次）。在1.2毫米，出现荧光标记的吗啉溶液的黄绿色，即使在正常光线条件下。每次注射，一个黄色的“噗”吗啉溶液可以可视化，这有助于本地化注射到胚。约75 NL（10-15点击）吗啉溶液应注射每骨射线。暂停〜1秒之间人次。我们只注入背侧，使用电，只有控制腹。另外，可以重复使用这一整个过程控制啉翅腹面的一半。 4。电，对吗啉紧随注射吗啉，从微注射器具注射板。填写麻醉液注射板鱼，直到被淹没。水位线下的电。 <李> 3毫米直径的铂金板钳电极（CUY 650-P3镊子，保得国际）定位脉冲约一个半翅。小心不要触摸电极鳍组织。为了确保电极不接触鳍组织，在其背侧旋转的鱼和直视下电中线。 Electroporate都背，腹（控制一个非特定的电效应）使用1 CUY21广场，波Electroporator（保得国际公司）双方的鳍。擦拭后，每个电潮湿KimWipe，以消除任何可能形成的泡沫电极。如果他们不删除，迷你负责建立，这将吸引组织向电极。应设置连续十50毫秒脉冲的电参数，在15至五1秒脉冲之间的停顿。 将玻片或培养皿和快速的图像鳍鱼，确保到n大手，背/腹方向。翌日，该图像将被用于再生分析。鱼返回到坦克。 5。分析如果目标蛋白表达下调被撞倒在适当的鳍再生，显着的差异之间的鳍背，腹部分应该是很明显的后1天，电（ 图5B）。 在3 DPA，另取每条鱼的鳍的图片，并匹配相应的2 DPA（ 图5B）这个图片。在动物之间的鳍色素沉着模式的自然变化将使你正确识别个别鱼。 使用NIH图像，追踪2的背部和腹部的一半（ 图5B）政治部和3 DPA领域。 要确定面积背侧与腹侧使用下列公式：％（背3dpa -背2dpa的 ）/（腹3dpa -腹侧2dpa）×100 =％面积 6。代表结果我们始终检测鳍生长在3 DPA，或24 HPE（小时后电）。荧光标记的吗啉在这个时候，应该在目前的鳍背一半（ 参考图1和图6A）。看到一些尾随截肢的水平，这是正常的。 与控制吗啉代（ 图6B）注射和电穿孔的鳍背，腹两侧之间不应该有差异。 如果实验啉目标鳍生长必需的蛋白质，背侧和腹侧双方之间的巨大差异，应遵守（ 图6C）。 如果电极在电鳍感动，该组织将出现褐色（在外观上几乎烧毁）和坏死。 “SRC =”/ files/ftp_upload/3632/3632fig1.jpg“/> 图1。鳍再生过程中发生的各种事件的示意图。每个事件的相关时间以小时后截肢（HPA）和对应的水箱温度33°C。 图2。注塑板，这是由琼脂糖和包含一个小以及期间举行的注射吗啉鱼的示意图。 图3。鱼菜头鱼在缺口啉显微注射示意图。A.将切出井，这将有助于鱼保持稳定。B.在低倍率，安排针，使靠近鳍的再生组织。 </stro吴>在更高的放大倍率，注入啉远端各骨的鳍条（即在每个芽）。针应该进入只是远端骨射线（1），组织，然后继续胚（2）的位置。注：在原理图中的绿色圆圈，只是为了显示注射的位置。吗啉绿色/黄色“噗”，每次注射后，可以简单的可视化;然而，这并不存在，如示意图所示。 图4。鳍电原理图。A.显微注射后，放置在培养皿全麻醉的鱼和electroporate背，腹部分。确保不碰鱼翅组织。电极应放在〜1毫米的组织。 <strong图5。用来计算鳍生长抑制的方法示意图。A.以政治部，无论之前或之后立即啉注射和电鳍鱼的每个图片。跟踪背（绿色）和腹侧（蓝色），NIH图像（黑色虚线）B.使用3 DPA鳍半再生组织，采取其他各鳍的图片，并再次追踪的背，腹地区再生利用NIH图像。减去2 DPA在3 DPA对于背部和腹部的富人总再生的再生领域。 ％背侧与腹侧重新生长面积，可以计算公式：（（四3dpa – D 2 DPA）/（五3dpa – 2dpa至五））×100。百分之抑制= 100 – ％的面积。 预计图6。结果。A.控制啉荧光素标记的荧光图像显示在鳍背一半，24小时后电（HPE）。明视图像的注射与控制啉电穿孔的鳍背半。图像显示的背部和腹部的鳍，24 HPE半等于再生。背半的实验吗啉，注射和电穿孔翅片C.明视的形象。图像显示背/注射侧抑制再生。行显示的金额在2 DPA，紧接啉注射和电再生。 图7。交替注入和电在伤口愈合和胚形成过程涉及到目标蛋白的示意图。A.注入啉彼此之间骨鳍条上的鳍背一半。Electroporate按正常吗啉。C.截肢鳍立即注射部位近端（〜1骨段）。荧光标记啉可以观察在伤口上皮细胞和胚在24 HPE。 B.图8。使用的技术为目标伤口上皮细胞和胚形成。明视在24百帕鳍控制啉注射，电穿孔立即截肢前的形象。鳍的荧光图像显示在面板A.注意注入一半的鳍背，显示了良好的再生组织中摄取的吗啉。 C – C“的高倍在面板中显示的鳍背一半，A和B注射部位往往仍清晰可见（箭头）但许多有针对性的细胞迁移参与创面上皮细胞和胚形成（箭头）。 图9。利用这一技术来针对细胞迁移到形成胚。A.荧光灯和明显示鳍注入，背，腹部分啉电穿孔的插图图像。在两架飞机的鳍，然后截肢。背半立即被切断，远端注射部位，那里的腹侧被削减一半9-10远端注射部位的骨段。B.在24百帕，荧光灯和明插图图像表明，吗啉已迁移到背再生（1），而不是腹重生（2），这表明仅在细胞立即截止站点近端参加原基形成。两套白色箭头显示每个截肢飞机。板上标明的最右边的图像显示更高的放大倍率视图的鳍背，腹部分，分别为1和2。 参考图1。一个视频共聚焦Z-Stack的一个区域对应的胚在鳍控制啉注射和电穿孔的位置。 24 HPE图像。由于单个荧光分子不能显示，不是所有的吗啉可以可视化或量化。然而，这些图片给一些吸收不同程度的细胞，从单个点状点，吗啉荧光充满整个细胞，可以在可视化的想法。在静止图像上，方向显示。比例尺：25微米。