En electroporación in vivo de Morpholinos en la regeneración de adultos de pez cebra Aleta de cola

1. Volver a suspender Morpholino Diluir 300 nM de fluoresceína-etiquetados morfolino en 100 l de agua libre de nucleasa para hacer una solución mM aproximadamente 3. La solución morfolino se repartió en alícuotas en tubos de microcentrífuga múltiples sellados en parafina y se almacena a temperatura ambiente y lejos de la luz. Para determinar la concentración exacta morfolino, diluir 5 l de solución morfolino (o agua como un espacio en blanco) en 95 l de 0,1 N HCl. Establecer una línea de base en un espectrofotómetro a 265 nm con el blanco de agua y luego determinar la lectura de la solución diluida de morfolino. Multiplicar la absorbancia morfolino por su constante determinada y por el factor de dilución para determinar la concentración en ng / l. La constante morfolino se calcula como: Morfolino constante = peso molecular de la absorbancia X morfolino 1000/molar. El peso molecular y coeficiente de absorción molar para el morfolino se puede encontrar en el "Oligo Propiedades "hoja proporcionada con el producto. Dividir la concentración morfolino, en ng / l, por el peso molecular para determinar la concentración en mM. Diluir el morfolino, si es necesario, a una concentración de trabajo, típicamente 1,2 mM. 2. Fin de amputación Anestesie pez cebra adulto en cualquiera tricaína o 2-fenoxietanol a 1,0 mg / ml en agua del tanque. Amputar la aleta utilizando una cuchilla de escalpelo estéril u hoja de afeitar proximal a la primera punto lepidotrichial ramificación. Esto debe hacerse en la misma proximal / distal localización en cada animal (por ejemplo, 7 segmentos óseos distales de la cintura de la aleta). IMPORTANTE: asegúrese de cortar perfectamente perpendicular al plano anterior / posterior del animal. Los cortes en ángulo dará lugar a consecuencia de la aleta desigual de las mitades dorsal y ventral de la aleta. Volver a los peces a un tanque. Por lo general mantener el pescado a 33 ° C para aumentar la tasa de regeneración. Dependiendo del diseño experimental, wait 0-2 días después de la amputación (dpa) para la regeneración de la aleta para comenzar antes de introducir el morfolino. Enfoques alternativos se discuten en la discusión, a continuación. 3. Morpholino inyección El día antes de inyectar el morfolino, hacer una placa de inyección (Figura 2). Asegúrese de cortar una muesca en un extremo del pozo, lo que ayuda a estabilizar el pescado para el procedimiento de microinyección. A las 2 de dpa, preparar el aparato de inyección de micro-y la solución de morfolino. Diluir el marcados con fluoresceína morfolino a la concentración adecuada (se recomienda a partir de 1,2 mM) y colóquelo en un baño María a 65 ° C el agua, durante 5 minutos. Tire de la aguja de vidrio para la inyección de micro-utilizando un extractor de la aguja. Coloque la aguja con el morfolino (nota: en función de si hace una copia de relleno o de carga frontal, la aguja se determinará si se carga la primera aguja, o cortar la punta de la primera). Corte la punta de la aguja en unn ángulo. Siga las instrucciones de su sistema de micro-inyección para inyectar una burbuja de aproximadamente el 5 nl de morfolino por inyección. Los mayores volúmenes de morfolino podría alterar el tejido. Anestesiar el pescado y colóquelo en la placa de la inyección. Retire todo el exceso de líquido y orientar la aguja en el lugar apropiado, justo por debajo de la raya ósea (Figura 3). Utilizando un microscopio y un aparato apropiado para microinyección morfolino inyecciones (véase la Tabla de los reactivos específicos), inyectar el morfolino en la aleta de delante a atrás, como se muestra en la Figura 3. La inyección de atrás hacia delante hace que el tejido de la aleta para enrollar durante la inyección y es muy difícil. Inserte la aguja suavemente en el tejido regenerativo, justo por debajo de cada rayo ósea (marcado "1" en la Figura 3) y empuje hacia distal hasta el situado en el blastema ("2" en la Figura 3). Tenga cuidado de no empujar la aguja a través de la en-aleta neumático. Cuando la aguja está correctamente localizado, inyectar el morfolino (es decir, haga clic una sola vez). De 1,2 mm, el marcados con fluoresceína morfolino solución aparece de color amarillo-verde, incluso en condiciones normales de luz. Con cada inyección, un amarillo "bocanada" de solución morfolino puede ser visualizado, que ayuda a localizar la inyección para el blastema. Aproximadamente el 75 nl (10-15 clics) de la solución de morfolino debe inyectarse por rayos ósea. Pausa ~ 1 segundo entre los clics. Sólo se inyectan en la cara dorsal, ventral, con la electroporación de sólo control. Alternativamente, se podría repetir este procedimiento entero usando un morfolino control en el medio ventral de la aleta. 4. La electroporación de los morfo- Inmediatamente después de la inyección de la morfolino, retirar la placa de inyección desde el aparato de inyección de micro-. Completa la placa de pozo de inyección con la solución de anestesia hasta que el pescado se sumerge. La electroporación se lleva a cabo bajo la línea de agua. <li> Un platino 3 mm de diámetro de la placa de electrodo pinza (CUY 650-P3 pinzas, Protech Internacional) se localizan los pulsos a aproximadamente la mitad de la aleta. Tenga cuidado de no tocar los electrodos en el tejido de la aleta. Para asegurarse de que los electrodos no se tocan el tejido de la aleta, girar el pescado en su parte dorsal y mirar hacia abajo de la línea media de la electroporación. Electroporar tanto la dorsal y ventral (para el control de algunos efectos no específicos de electroporación) lados de la aleta con una onda cuadrada CUY21 Electroporador (Protech International, Inc.). Limpie los electrodos con un KIMWIPE húmedo después de cada electroporación para eliminar las burbujas que puedan haberse formado. Si no se retiran, un mini-carga se acumula, lo que atraerá a los tejidos hacia el electrodo. Los parámetros de electroporación se debe establecer en diez impulsos consecutivos 50 mseg, a 15 V con una pausa de 1 seg entre impulsos. Coloque el pescado sobre un portaobjetos de vidrio o placa de Petri y rápidamente la imagen de la aleta, asegurándose de que nover la orientación dorsal / ventral. Esta imagen se utiliza para el análisis recrecimiento en el día siguiente. Volver a los peces en el tanque. 5. Análisis Si la proteína blanco que fue derribado en la expresión es necesaria para la regeneración de la aleta adecuada, una gran diferencia entre las mitades dorsal y ventral de la aleta debe ser evidente un día después de la electroporación (Figura 5B). A las 3 de dpa, tomar otra foto de la aleta de cada uno de los peces y hacer coincidir la imagen con la que corresponde la imagen 2 dpa (Figura 5B). La variación natural en el patrón de pigmentación de la aleta entre los animales le permitirá identificar correctamente a los peces. Usando la imagen del NIH, trazar las zonas 2 y 3 dpa dpa de las dos mitades de los dorsales y ventrales (Figura 5b). Para determinar el área% del uso de dorsal ventral versus la fórmula siguiente: (dorsales 3dPA – dorsales 2dpa) / (ventral 3dPA – 2dpa ventral) X 100 =% de superficie 6. Los resultados representativos Siempre ensayo para la extensión de la aleta a las 3 hpe dpa, o 24 (horas después de la electroporación). En este momento, el morfolino marcados con fluoresceína debe estar presente en el medio dorsal de la aleta (Figura Suplementario 1 y Figura 6A). Es normal ver algunos trasero hasta el nivel de la amputación. No debería haber ninguna diferencia entre las partes dorsal y ventral de la aleta inyectado y electroporación con los morfolinos de control (Figura 6B). Si el grupo experimental morfolino dirige una proteína esencial para la extensión de la aleta, una gran diferencia entre las partes dorsal y ventral se observó (Figura 6C). Si el electrodo tocado la aleta durante la electroporación, el tejido aparecerá marrón (casi quemado en apariencia) y necrótico. "Src =" / files/ftp_upload/3632/3632fig1.jpg "/> Figura 1. Esquema de los diferentes eventos que se producen durante la regeneración de la aleta. Los tiempos que subyacen en cada caso se dan en la hora posterior a la amputación (HPA) y corresponden a una temperatura del tanque de 33 ° C. Figura 2. A. Esquema de la placa de inyección, que está hecho de agarosa y contiene una pequeña bien para mantener el pescado durante la microinyección del morfolino. Figura 3. Esquema de microinyección morfolino. A. Coloque el pescado en el plato con la cabeza de los peces en la muesca del pozo, lo que ayudará a los peces se mantienen estables. B. A menor aumento, arreglar la aguja de modo que que está cerca de la regeneración de tejido de la aleta. C. </stro> ng A mayor aumento, inyectar el distal a cada rayo de la aleta ósea (es decir, en cada uno de blastema) morfolino. La aguja debe entrar en el tejido distal al rayo ósea (1), y luego continuar a la ubicación de la blastema (2). Nota: los círculos verdes en el esquema sólo se pretende mostrar la ubicación de la inyección. El morfolino brevemente puede ser visualizado como una verde / amarillo "bocanada" después de cada inyección, sin embargo, esto no persiste como se muestra en el esquema. Figura 4. Esquema de la electroporación de la aleta. A. Tras la microinyección, coloque el pescado en una placa de Petri completa de la anestesia y electroporar tanto las mitades dorsal y ventral. B. Asegúrese de no tocar el tejido de la aleta. Los electrodos se colocan ~ 1 mm del tejido. <strong> Figura 5. Esquema de los métodos utilizados para calcular la inhibición de la aleta consecuencia. A. Tome una fotografía de la aleta de cada uno de los peces a las 2 de dpa, ya sea inmediatamente antes o después de la inyección morfolino y electroporación. Trace el tejido regenerativo, tanto de la dorsal (verde) y ventral (azul) mitades de la aleta con NIH Image, (líneas negras discontinuas). B. A las 3 de dpa, tomar otra fotografía de cada aleta y otra vez trazar las áreas dorsal y ventral de rebrote con NIH Image. C. Restar el área de nuevo crecimiento en dos DPA de la regeneración total en tres dpa, tanto para los que tienen dorsal y ventral. El porcentaje de área de dorsal ventral versus re-crecimiento se puede calcular usando la fórmula: ((D 3dPA – D dpa 2) / (V 3dPA – V 2dpa)) X 100. Porcentaje de inhibición = 100 – por ciento de área. Figura 6. Ejemplos de esperalos resultados. imagen A. fluorescente que muestra un marcados con fluoresceína de control morfolino en el medio dorsal de la aleta, 24 horas después de la electroporación (HPE). B. Brightfield imagen de una aleta que se inyectó y electroporación con un morfolino control en el medio dorsal . La imagen muestra el nuevo crecimiento igual de ambas las mitades dorsal y ventral de la aleta, de 24 años HPE. C. imagen de campo claro de una aleta que se inyecta y la electroporación con un morfolino experimental en la mitad dorsal. La imagen muestra la inhibición de la regeneración en el lado dorsal / inyectado. La línea muestra la cantidad de nuevo crecimiento en dos dpa, inmediatamente antes de la inyección morfolino y electroporación. Figura 7. Esquema de una inyección alterna y procedimiento de electroporación de proteínas diana implicados en la cicatrización de heridas y la formación del blastema. A. Inyecte el morfolinoentre cada radio de la aleta de hueso en la parte dorsal de la aleta. B. electroporar los morfo-como de costumbre. C. amputar la aleta inmediatamente proximal (~ 1 segmento óseo) en el sitio de la inyección. D. La marcados con fluoresceína morfolino se puede observar en el epitelio de la herida y la blastema a las 24 HPE. Figura 8. Utilizando la técnica para apuntar epitelio herida y la formación de blastema. A. imagen Brightfield de una aleta en 24 hPa que se inyectó y electroporación con un morfolino control inmediatamente antes de la amputación. Imagen B. fluorescente de la aleta se muestra en el panel A. Nota que el medio inyectado dorsal de la aleta muestra buena captación de la morfolino en el tejido regenerativo. C -. C "aumento mayor de la mitad de la aleta dorsal muestran en los paneles A y B. Los puntos de inyección a menudo son todavía visibles (puntas de flecha), Pero muchas células diana han migrado a participar en el epitelio y la formación de la herida blastema (flecha). Figura 9. Utilizando la técnica a células diana que migran para formar el blastema. A. fluorescente y las imágenes insertadas campo claro que muestran una aleta inyectado y electroporación con morfolino en ambas las mitades dorsal y ventral. La aleta fue amputada luego en dos planos. La mitad dorsal se cortó inmediatamente distal a los sitios de inyección, en tanto que la mitad ventral fue cortada 9-10 segmentos óseos distales a los sitios de inyección. B. A los 24 hPa, las imágenes en los recuadros fluorescentes y muestran que el campo claro morfolino ha migrado a la dorsal regenerar (1), pero no el regenerado ventral (2), lo que indica que sólo la celda inmediatamente proximal al sitio de corte participar en la formación de blastema. Los dos conjuntos de puntas de flechas blancas muestran el nivel de cada una amputaciónplano. Los paneles marcados 1 y 2 en el extremo derecho de la imagen muestran una vista mayor aumento de las mitades dorsal y ventral de la aleta, respectivamente. Suplementario Figura 1. Un video de un confocal z pila de una región correspondiente a la ubicación de un blastema en una aleta inyectado y electroporación con un morfolino de control. La imagen fue tomada a las 24 HPE. Puesto que una molécula de fluoresceína solo no puede ser visualizada, no todo el morfolino puede ser visualizado o cuantificado. Sin embargo, estas imágenes dan una idea de los diferentes grados de absorción que pueden ser visualizados en celdas individuales, a partir de puntos puntiformes, a células enteras llenas de fluorescentes morfolino. En la imagen fija, la orientación se muestra. Barra de escala: 25 micras.