In elettroporazione in vivo di Morpholinos nella Adult Regenerating Zebrafish Tail Fin

1. Risospendere Morpholino Diluire 300 Nm di fluoresceina-tagged morfolino in 100 microlitri di acqua priva di nucleasi di fare una soluzione circa 3 mM. La soluzione morfolino viene frazionato in più paraffina sigillati tubi da microcentrifuga e conservato a temperatura ambiente e al riparo dalla luce. Per determinare la concentrazione esatta morfolino, diluire 5 pl di soluzione di morfolino (o acqua come bianco) in 95 pl di 0,1 N HCl. Impostare una linea di base su uno spettrofotometro a 265 nm con il bianco acqua e quindi determinare la lettura della soluzione diluita morfolino. Moltiplicare l'assorbanza morfolino dalla sua costante determinata e per il fattore di diluizione per determinare la concentrazione in ng / pl. La costante morfolino viene calcolato come: Morfolino costante = peso molecolare della assorbanza X morfolino 1000/molar. Il peso molecolare e assorbanza molare per il morfolino si trova sul "Oligo "foglio Proprietà fornito con il prodotto. Dividere la concentrazione morfolino, in ng / pl, dal peso molecolare per determinare la concentrazione in mM. Diluire il morfolino, se necessario, ad una concentrazione operativa, tipicamente 1,2 mM. 2. Fin Amputazione Anestetizzare zebrafish adulto sia in Tricaine o 2-fenossietanolo di 1,0 mg / ml in acqua serbatoio. Amputare la pinna con una lama sterile bisturi o rasoio prossimale al primo punto lepidotrichial ramificazione. Questo dovrebbe essere fatto allo stesso prossimale / distale posizione su ogni singolo animale (ad esempio 7 segmenti ossei distali dalla cintura fin). IMPORTANTE: assicuratevi di tagliare perfettamente perpendicolare alla anteriore / posteriore piano dell'animale. Tagli angolari si tradurrà nella crescita fin irregolare delle due metà dorsali e ventrali della pinna. Ritorna il pesce ad un serbatoio. Noi di solito mantenere il pesce a 33 ° C per aumentare il tasso di rigenerazione. A seconda del disegno sperimentale, wait 0-2 giorni dopo l'amputazione (dpa) per la rigenerazione fin iniziare prima di introdurre il morfolino. Approcci alternativi sono discussi nella discussione, al di sotto. 3. Morfolino iniezione Il giorno prima di iniettare il morfolino, effettuare una piastra di iniezione (Figura 2). Assicurarsi per tagliare una tacca ad una estremità del pozzo, che contribuisce a stabilizzare il pesce per la procedura microiniezione. A 2 dpa, preparare la micro-iniezione di apparati e soluzioni morfolino. Diluire la fluoresceina tag morfolino alla concentrazione adeguata (consigliamo di iniziare con 1,2 mm) e mettere in un bagno di acqua a 65 ° C, per 5 minuti. Estrarre l'ago di vetro per la micro-iniezione con un estrattore ago. Caricare l'ago con il morfolino (nota: a seconda che si tratti di back-front-fill o caricare l'ago dovrà stabilire se si carica il primo ago, o tagliare la prima punta). Tagliare la punta fuori l'ago con unn angolo. Seguire le istruzioni del vostro micro-sistema di iniezione per iniettare uno circa 5 nl bolla di morfolino per iniezione. Grandi volumi di morfolino potrebbe distruggere il tessuto. Anestetizzare il pesce e posto sulla piastra di iniezione. Rimuovere tutto il liquido in eccesso e orientare l'ago nella posizione appropriata, appena distale al raggio osseo (Figura 3). Utilizzando un microscopio e apparato microiniezione appropriato per morfolino iniettabili (cfr. tabella di reagenti specifici), iniettare il morfolino nella pinna da anteriore a posteriore, come mostrato nella Figura 3. Iniettando da posteriore al anteriore causa il tessuto pinna per arrotolare durante l'iniezione ed è molto difficile. Inserire l'ago delicatamente nel tessuto rigenerativa, appena distale ad ogni raggio ossea (contrassegnata con "1" in figura 3) e spingere distalmente fino situato nel blastema (contrassegnata con "2" in figura 3). Fare attenzione a non spingere l'ago attraverso la enfin pneumatico. Quando l'ago è correttamente localizzata, iniettare il morfolino (cioè cliccare una sola volta). A 1,2 mm, la soluzione di fluoresceina-tagged morfolino appare giallo-verde, anche in condizioni di luce normali. Per ogni iniezione, un giallo "soffio" di soluzione morfolino possono essere visualizzati, che aiuta a localizzare l'iniezione al blastema. Circa il 75 nl (10-15 clicks) di soluzione morfolino deve essere iniettato per ray ossea. Pause ~ 1 sec tra un clic. Abbiamo solo iniettare il lato dorsale, utilizzando il ventrale come elettroporazione solo controllo. In alternativa, si potrebbe ripetere questa procedura intero utilizzando un morfolino controllo sulla metà ventrale della pinna. 4. Elettroporazione della morfolino Immediatamente dopo l'iniezione del morfolino, rimuovere la piastra di iniezione dal micro-iniezione apparato. Riempire la piastra pozzo di iniezione con la soluzione anestesia finché il pesce è sommerso. L'elettroporazione è eseguita sotto la linea di galleggiamento. <li> di 3 mm di diametro dell'elettrodo di platino piastra pinzetta (Cuy 650-P3 pinzette, Protech International) localizza gli impulsi a circa metà della pinna. Fare attenzione a non toccare gli elettrodi al tessuto pinna. Per assicurarsi che gli elettrodi non toccare il tessuto pinna, ruotare il pesce sul lato dorsale e guarda dritto verso il basso la linea mediana per l'elettroporazione. Elettroporare sia la dorsale e ventrale (per il controllo per un non-specifici effetti elettroporazione) i lati della pinna utilizzando una squadra CUY21 Onda Elettroporatore (Protech International, Inc.). Pulire gli elettrodi con una Kimwipe umido dopo ogni elettroporazione per eliminare eventuali bolle che possono essersi formate. Se non vengono rimossi, una mini-carica si accumula, che attirerà il tessuto verso l'elettrodo. I parametri di elettroporazione deve essere impostato a dieci impulsi consecutivi 50 msec, a 15 V con una pausa di 1 sec tra gli impulsi. Mettere il pesce su un vetrino o una scatola Petri e rapidamente l'immagine della pinna, avendo cura di nOTE l'orientamento dorsale / ventrale. Questa immagine viene utilizzata per l'analisi ricrescita il giorno successivo. Ritorna il pesce al serbatoio. 5. Analisi Se la proteina mirata che è stata abbattuta nel espressione è necessario per la rigenerazione fin corretta, una differenza enorme tra le due metà dorsali e ventrali della pinna dovrebbe essere evidente 1 giorno post-elettroporazione (Figura 5B). A 3 dpa, scattare un'altra foto della pinna di ogni pesce e abbinare questa immagine con l'immagine corrispondente 2 dpa (Figura 5B). La variazione naturale del modello di pinna pigmentazione tra gli animali vi permetterà di identificare correttamente i singoli pesci. Utilizzando immagini NIH, tracciare le 2 aree dpa e 3 dpa di entrambe le metà dorsale e ventrale (Figura 5B). Per determinare l'area% di utilizzo rispetto dorsale ventrale la seguente formula: (dorsali 3dpa – dorsali 2dpa) / (ventrale 3dpa – 2dpa ventrale) X 100 = area% 6. Risultati rappresentativi Abbiamo sempre saggio per outgrowth fin a 3 hpe dpa, o 24 (ore dopo la elettroporazione). A questo punto, la fluoresceina-etichettato morfolino dovrebbe essere presente nella metà dorsale della pinna (supplementare Figura 1 e Figura 6A). È normale vedere qualche finali fino al livello di amputazione. Non ci dovrebbe essere differenza tra i lati dorsale e ventrale nella pinna iniettato e elettroporate con il Morpholinos controllo (Figura 6B). Se il morfolino sperimentale destinato a una proteina essenziale per la pinna escrescenza, una differenza drammatica tra i lati dorsale e ventrale deve osservare (Figura 6C). Se l'elettrodo ha toccato la pinna durante elettroporazione, il tessuto apparirà marrone (quasi bruciato in apparenza) e necrotico. "Src =" / files/ftp_upload/3632/3632fig1.jpg "/> Figura 1. Schematica dei vari eventi che si verificano durante la rigenerazione della pinna. I tempi alla base di ogni evento sono indicati in ore post-amputazione (hpa) e corrispondono ad una temperatura del serbatoio di 33 ° C. Figura 2. A. Schematica della piastra di iniezione, che è fatto di agarosio e contiene un pozzetto per tenere il pesce durante microiniezione del morfolino. Figura 3. Schema di microiniezione morfolino. A. Inserire il pesce nel piatto con la testa del pesce nella tacca tagliato fuori dal pozzo, che aiuterà il pesce resta stabile. B. A basso ingrandimento, disporre l'ago in modo che è vicino al tessuto rigenerazione della pinna. C. </stro> ng A maggiore ingrandimento, iniettare il distale per ogni raggio fin ossea (cioè in ogni blastema) morfolino. L'ago deve entrare nel tessuto appena distale al raggio ossea (1), e poi proseguire fino alla posizione del blastema (2). Nota: i cerchi verdi nello schema servono solo per mostrare la posizione di iniezione. Il morfolino può brevemente essere visualizzato come una giallo / verde "sfoglia" dopo ogni iniezione, tuttavia, questo non persistono come mostrato nello schema. Figura 4. Schema di elettroporazione pinna. A. In seguito a microiniezione, mettere il pesce in una capsula di Petri piena di anestesia e elettroporare entrambe le parti dorsali e ventrali. B. Assicurarsi di non toccare il tessuto pinna. Elettrodi deve essere posto ~ 1 mm dal tessuto. <strong> Figura 5. Schema dei metodi utilizzati per calcolare l'inibizione fin escrescenza. A. Scatta una foto della pinna di ogni pesce a 2 dpa, o immediatamente prima o dopo l'iniezione morfolino ed elettroporazione. Tracciare la tessuti rigenerabili sia della dorsale (verde) e ventrale (blu) metà della pinna con NIH Image, (linee nere tratteggiate). B. A 3 dpa, scattare un'altra foto di ciascuna aletta e di nuovo risalire le zone dorsale e ventrale di ricrescita usando l'immagine NIH. C. Sottrarre la zona di ricrescita a 2 dpa dalla ricrescita totale a 3 DPA sia per i ricchi dorsale e ventrale. L'area percentuale di dorsale rispetto ventrale ricrescita può essere calcolata utilizzando la formula: ((D 3dpa – D DPA 2) / (V 3dpa – 2dpa V)) X 100. Percentuale di inibizione = 100 – Area per cento. Esempi Figura 6. Di attesarisultati. immagine A. fluorescente che mostra una fluoresceina-tag controllo morfolino nella metà dorsale della pinna, 24 ore post-elettroporazione (hpe). B. immagine Brightfield di una pinna che è stato iniettato e elettroporata con un morfolino controllo nella metà dorsale . L'immagine mostra la ricrescita parità di entrambe le parti dorsali e ventrali di una pinna, 24 hpe. C. Brightfield immagine di una pinna che è stato iniettato e elettroporate con un morfolino sperimentale nella metà dorsale. L'immagine mostra inibizione della ricrescita sulla dorsale / iniettato lato. La linea mostra la quantità di ricrescita a 2 dpa, immediatamente prima dell'iniezione morfolino ed elettroporazione. Figura 7. Schema di un'iniezione alternativo e procedura di elettroporazione alle proteine ​​bersaglio coinvolti nella guarigione delle ferite e la formazione di blastema. A. Iniettare il morfolinotra ciascun raggio aletta ossea sul mezzo dorsale della pinna. B. elettroporare la morfolino come al solito. C. amputazione della pinna immediatamente prossimale (~ 1 segmento osseo) al sito di iniezione. D. La fluoresceina-morfolino etichettato può essere osservato nell'epitelio delle ferite e blastema a 24 hpe. Figura 8. Utilizzando la tecnica di indirizzare l'epitelio della ferita e la formazione blastema. A. Brightfield immagine di una pinna a 24 hpa che è stato iniettato e elettroporate con un morfolino controllo immediatamente prima dell'amputazione. B. immagine fluorescente di pinna mostrato nella nota pannello A. che il mezzo iniettato dorsale della pinna mostra l'assorbimento bene della morfolino nel tessuto rigenerativa. C -. C "ingrandimento superiore della metà dorsale della pinna mostrato in pannelli A e B. I siti di iniezione sono spesso ancora visibili (frecce), Ma molte cellule bersaglio sono migrati a partecipare nell'epitelio delle ferite e la formazione di blastema (freccia). Figura 9. Utilizzando la tecnica per colpire le cellule che migrano per formare l'. Blastema A. fluorescente e le immagini che mostrano brightfield incasso una pinna iniettato e elettroporate con morfolino su entrambe le metà dorsale e ventrale. La pinna è stata poi amputata a due piani. La parte dorsale è stata tagliata immediatamente distale ai siti di iniezione, dove, come la metà ventrale è stata tagliata 9-10 segmenti ossei distali ai siti di iniezione. B. A 24 anni hpa, le immagini fluorescenti e brightfield incasso dimostrano che morfolino sia migrata alla dorsale rigenerare (1), ma non rigenerato ventrale (2), indicando che solo la cella immediatamente prossimale al sito di taglio partecipare alla formazione blastema. Le due serie di frecce bianche indicano il livello di ogni amputazioneaereo. Pannelli segnato 1 e 2 all'estrema destra dell'immagine mostra una vista ingrandimento maggiore delle due metà dorsali e ventrali della pinna, rispettivamente. Supplementare Figura 1. Un video di un microscopio confocale z-pila di una regione corrispondente alla posizione di un blastoma in una pinna iniettato e elettroporata con un morfolino controllo. L'immagine è stata scattata a 24 hpe. Poiché una singola molecola fluoresceina non può essere visualizzata, non tutto il morfolino può essere visualizzata o quantificati. Tuttavia, queste immagini danno un'idea dei vari gradi di assorbimento che possono essere visualizzati nelle cellule, da singoli punti puntata, alle cellule intere piene di morfolino fluorescente. Sul fermo immagine, l'orientamento viene mostrato. Scale bar: 25 micron.