High-throughput Detection Methode voor Influenza Virus

1. MDCK cellen cultuur Culture 5 miljoen MDCK cellen overnachting in een T-75 cm 2 kolf in 20 ml van RPMI1640 compleet medium met 10% FBS, 100 U / ml penicilline, 100 pg / ml streptomycine, 1 mM natriumpyruvaat, 5% van 7,5% natriumbicarbonaat oplossing en 0,001% β-mercaptoethanol in een 37 ° C incubator geïnfundeerd met 5,2% CO 2. 2. PR8 infectie en BAL vloeistof collectie Challenge C57BL / 6 muizen intranasaal met 5.000 PFU van PR8 virus in steriele PBS in een totaal volume van 30 pi door een neusgat. Voer mock infecties met alleen steriele PBS zonder het virus. Euthanaseren muizen 0, 2, 4 en 7 dagen na infectie en snijd van de borstholte te openen en een 1 cm incisie parallel aan de luchtpijp via de vacht van de muis om het bloot te leggen. Maak een middellijn incisie op de proximale aspect van de luchtpijp. Infundeer de luchtpijp met 0,5 ml van PBS-1% BSA en aspireer het BAL vloeistof. BAL vloeistoffen kunnen worden opgeslagen in -20 ° C diepvriezer tot gebruik. 3. Virus infectie en detectie van virale matrix eiwit (M2) met de LI-COR Odyssey Om de virale titers met behulp van infrarood-dye-geconjugeerde antilichamen te kwantificeren, de oogst van het MDCK cellen van T-75 cm 2 flessen en plaat ze in optische vlakke bodem zwart 96-well (10.000 cellen per well) of 384-wells (5.000 cellen per well ) platen. Cultuur de MDCK cellen voor overnachting bij 37 ° C in RPMI1640 compleet medium en tweemaal spoelen met serum-vrij DMEM bevattende BSA (0,2%, gewicht / volume), penicilline (100 U / ml), streptomycine (100 pg / ml), natrium pyruvaat (1 mM), natriumbicarbonaatoplossing (5% van 7,5%) en β-mercaptoethanol (0,001%). Incubeer de MDCK cellen met BAL vloeistof (50 ul voor 96-wellsplaat of 10 ul voor 384-wells plaat) of PR8 virus met bekende titers in elke well met gelijke volume (50 ul voor 96-wellsplaat of 10 ul voor 384 – wells plaat) van DMEM medium,bevattende L-1-tosylamido-2-fenylethyl chloromethyl keton (TPCK) behandelde trypsine (0,2 ug / ml). Na 1 h van infectie, voeg 100 pi (96-well plaat) of 20 ul (384-wells plaat) van 10% FBS-bevattende RPMI1640 complete medium in elk putje. Doorgaan kweken MDCK cellen voor een andere 16 h besmettingsbronnen; tweemaal was de MDCK cellen met 100 pi (96-well plaat) of 20 ul (384-wells plaat) van PBS-1% BSA oplossing en vast met 100 ul (96-well plaat) of 20 ul (384-wells plaat) van 1% paraformaldehyde voor 5 min. Na vaststelling, incubeer het MDCK cellen verder gedurende 30 min met 100 ul (96-well plaat) of 20 ul (384-wells plaat) van PBS-1% BSA voor het blokkeren. Na blokkering incubeer het MDCK cellen voor 1 h met primair antilichaam tegen M2-eiwit (1:1000, verdund in PBS-1% BSA). Gebruik 50 pi per well en 20 pi verdunde antistof per goed in 96-goed of 384-wells platen, respectievelijk. Driemaal Was MDCK cellen met 100 pi (96-well plaat) Of 20 ul (384-wells plaat) van PBS-bevattende 1% BSA en incubeer gedurende 1 uur met 50 ul (96-well plaat) of 20 ul (384-wells plaat) geit anti-muis IRDye @ 800 secundair antilichaam ( 1:200 verdunning). Driemaal Was MDCK cellen met 100 ul PBS-bevattende 1% BSA. Leg de gekleurde platen op het lezen glas platform van de LI-COR Odyssey IR-scanner en zet de lezer voor een 96 – of 384-wells plaat lezen. Blank putjes voor negatieve controle kan worden ingesteld met behulp van de LI-COR Odyssey software. Kwantificeren hele plaat of geselecteerde bronnen binnen de plaat met behulp van LI-COR Odyssey software. Met behulp van Auto Shape Tool, trekken de grenzen van een doelgebied (ROI) in het midden van een test goed van 96 – of 384-wells platen. Oprichting van ROI kan de software om de gedefinieerde achtergrond putten te vergelijken met het virus getitreerd monsters. Om de uitgangswaarde voor de hele test instellen, gebruikt u een achtergrond ROI. Breng de twee tegengestelde dradenkruis die door de Odyssey software binnen de ROI te meetopnieuw de intensiteit van de fluorescentie in de put. Scan platen met behulp van 780 nm kanaal voor detectie en 680 nm als referentie golflengte in een LI-COR Odyssey IR-scanner. Zodra de 'Read' commando wordt geactiveerd, zal de fluorescentie-intensiteiten op een uniforme intervallen van de ROI worden gemeten en de verzamelde gegevens points geïntegreerd. Een standaarddeviatie multiplier zal bepalen het niveau van het signaal over de baseline, dat is opgenomen in de ROI bepalen. Background fluorescentie zal gekwantificeerd uit de mock-geïnfecteerde of secundaire antilichaam alleen controleert en zullen worden gebruikt om de geïntegreerde intensiteit in test wells schatten. Kies 'geïntegreerde intensiteit' voor de berekeningen omdat het netto-pixel volume voor een bepaalde individuele plek en is onafhankelijk van de feature size. Gebruik de standaardcurve uit de bekende virale titers aan de virale titers van onbekende monsters berekenen. Gebruik een lange interpolatie curve precies kan worden berekend van de virale titers. Bereken de viral titers in de testmonsters door vergelijking van de intensiteiten van de testmonsters met de standaard curve. 4. Representatieve resultaten Standaardisatie van IR op dye-basis high throughput virale detectie systeem PR8 virus kan infecteren MDCK cellen; daarom gebruikten we deze cellen deze assay ontwikkelen. We gemeten de virale titers behulp van een primair antilichaam tegen een influenza virale matrix eiwit (M2). In tegenstelling tot andere methodologieën, gebruikten we een secundair antilichaam die is geconjugeerd aan een bijna-IR kleurstof. Deze methode biedt een eenvoudige, geautomatiseerde PR8 virus titer bepaling door middel van fluorescentie-intensiteit die wordt gegenereerd bij het detecteren van M2-eiwit. Na influenza virus infectie wordt M2-eiwit vertaald, vervoerd en accumuleert in de gastheercel inclusief de celoppervlak. Aldus de hoeveelheid van het M2-eiwit vertegenwoordigt een meetbare parameter om de hoeveelheid het virus bepalen. Vergelijking van de intensiteiten vande analysemonsters met de standaard curve zorgt de precieze meting van virale titers. Om te bepalen de werkzaamheid van het fluorescentie gebaseerde methode, we gekweekte 10 4 MDCK cellen / putje in kamer glijdt overnachten. PR8 virale voorraden bekende titers werden toegevoegd aan putjes tweevoud met verschillende plaque vormende eenheden (PFU) en toegestaan ​​om adsorberen aan de cellen gedurende een uur. Cellen werden geïncubeerd gedurende 16 h om de virus kan propageren. Hierna werden de MDCK cellen in de kamer slides gefixeerd met 1% paraformaldehyde, gewassen en gekleurd met anti-M2 antilichaam voor 1 h, gevolgd door AlexaFluor 488-geconjugeerd secundair antilichaam voor een extra 1 h. Confocale microscopische analyses van de geïnfecteerde MDCK cellen aangetoond dat de aanhanger monolaag was grotendeels intact en de PR8-afgeleide M2-eiwit was overvloedig aanwezig in de geïnfecteerde MDCK cellen (figuur 1a). Fluorescerende cellen kon worden gedetecteerd in infecties met virale titers zo laag als 10 2 </sup>. Deze analyses bleek ook dat het aantal fluorescerende MDCK cellen per well waren rechtstreeks evenredig aan de toenemende PR8 virale titers. Hoewel, het optische rendement van argon laser-based fluorochroom excitatie biedt levensechte cellulaire beelden, zijn smalle signaal ruisverhouding en het autofluorescentie van de cellen maken virale kwantificeringen uiterst moeilijk, vooral bij lagere titraties. Daarom, om een ​​nauwkeurige schatting virale methode vast te stellen hebben we in dienst van een IR-dye-gebaseerde detectie en kwantificering systeem. MDCK cellen (10 4 / putje) werden gekweekt in 96-well platen, besmet met PR8 en virale proteïnen werden gedetecteerd met behulp anti-M2 gevolgd door een IR dye-geconjugeerd secundair antilichaam. Het gebruik van anti-M2 antilichaam liet ons toe de antigen-specifieke fluorescentie-intensiteit gebruiken als direct metric van virale kwantiteit. Om de fluorescentie-intensiteit te sommen, gebruikten we de LI-COR Odyssey op basis van IR-scanner. Dit systeem maakt gebruik van twee kanaals laser-based IR detecties te fluoroforen identificeren en zij zich onderscheiden van achtergrondruis. Het eerste kanaal enthousiast op 680 nm en stoot op 700 nm om te helpen op de achtergrond te kwantificeren. Het tweede kanaal detecteert fluoroforen dat prikkelen bij 780 nm en uitzenden op 800 nm. Het scannen van PR8-geïnfecteerde MDCK cellen in LI-COR Odyssey wees op een virale titer-afhankelijke heldere fluorescentie (Figuur 1B). M2 positieve fluorescerende MDCK cellen waren duidelijk zichtbaar binnenin de gootjes (Figuur 1B). Een positieve correlatie van fluorescentie-intensiteit van het virus titer vanaf 10 2 -10 5 PFU kon consequent in acht worden genomen. PR8 virale titraties hoger dan 10 6 PFU leiden tot celdood, die een bovengrens voor de gevoeligheid van de assay sets. Minimale maar detecteerbare positiviteit consistent gezien met 10 2 -10 3 PFU PR8 virale titers aangetoond dat de hoge gevoeligheid van de bijna-IR kleurstoffen. De signaal-ruisverhouding werd bepaald door vergelijking van de mock-besmet of isotype antilichaam behandelde MDCK cellen. Beide van deze controles geleid tot te verwaarlozen was of niet-detecteerbare niveaus van fluorescentie (Figuur 1B). Verder verbeteren de gevoeligheid en de test monstervolume te verminderen, we software heeft 5 × 10 3 MDCK cellen / putje in 384-wells platen. Verschillende PFUs van PR8 werden getest als seriële een log verdunningen (Figuur 1C). Detection gevoeligheid vanaf 384-wells platen was vergelijkbaar met die van de 96-well plaatanalyses. Zowel 10 1 en 10 2 PFU werkte consequent beter in de 384-wells platen vergelijking met 96-wells platen. Met behulp van de fluorescentie-intensiteiten van 96 – of 384-wells plaat formaten, bouwen we standaard titratiecurven (figuur 1D). In deze berekeningen, de eerste variabele het virale titer terwijl de tweede variabele is de fluorescentie-intensiteit. Daarom gebruikten we de exponentiële verdeling om een ​​curve-fit aan determ genererenIne zeggen het polynoom relatie tussen de virale titers en fluorescentie intensiteiten. We hebben ook gevalideerd onze observaties met ander antilichaam dat wordt gericht tegen de nucleoproteïne (NP) van PR8 virus (gegevens niet getoond). Distinct bronnen van PR8 stammen werden ook gebruikt om MDCK cellen die waren getest met anti-NP of anti-M2 antilichamen (gegevens niet getoond) infecteren. Gezamenlijk kunnen we concluderen dat IR op dye-basis eiwitdetectie systeem kan helpen bij de diagnose infecteren virusstammen en precies opsomming gegeven van de titer van het infecterende ziekteverwekkers. Wiskundige overwegingen voor de berekening virale titers De wiskundige berekeningen van fluorescentie intensiteit en titer bepalingen gebeuren als hieronder beschreven. Na de kleuringsprocedure, zijn hele plaat of geselecteerde bronnen binnen plaat gekwantificeerd met behulp van LI-COR Odyssey software. Met behulp van Auto Shape Tool, werd grenzen van een doelgebied (ROI), opgesteld in het midden van de test putten van 96 – of 384-well platen (Figuur 2A en B). Oprichting van ROI kan de software om de gedefinieerde achtergrond putten te vergelijken met het virus getitreerd monsters. Een achtergrond ROI werd gebruikt om de basislijn waarde voor de hele assay stellen. Twee tegengestelde kruis haren (wit) werden geïntroduceerd binnen de ROI om de intensiteit van fluorescentie meten over de goed (Figuur 2C). Curves naar de rechterkant en onder de vertegenwoordiger wells in figuur 2C vertegenwoordigen de intensiteit van de pixels langs deze dradenkruis. De fluorescerende intensiteiten op uniforme intervallen van de ROI werden gemeten en de verzamelde gegevens punten werden geïntegreerd. Een standaarddeviatie multiplier bepaald het niveau van het signaal over de baseline, dat werd opgenomen in de ROI bepalen. Achtergrond fluorescentie werd gekwantificeerd van de mock-geïnfecteerde of secundaire antilichaam alleen controles en gebruikt om de geïntegreerde intensiteit in de test putten te schatten. We kozen geïntegreerde intensiteit voor berekeningen omdat het representatiefouders netto pixel volume voor een bepaalde individuele plek en is onafhankelijk van de feature size. Bovendien, geïntegreerde intensiteit nagenoeg onafhankelijk is van resolutie. Total intensiteit / pixel (I) correspondeert met de signaal intensiteit voortvloeien uit de goed geselecteerd in de pixeloppervlak (Is) plus het signaal voortvloeien uit de achtergrond van de pixeloppervlak (b). Daarom is voor pixel 'i': Ik i = i s i + b i Pixel volume vertegenwoordigt zowel de grootte van het signaal en het gebied waarin het wordt gedistribueerd. Signal gebied is gerelateerd aan de verdeling van steekproefgemiddelden dat genereert het signaal. De pixel volume gelijk is aan totale signaal gemeten in pixel 'i' in het gebied (a) van de pixel keer de hoogte (I). Dus voor pixel 'i': vi = a I i Totaal aantal pixel volume is de som van het totaal signaal van het hele gebied als volgt: ; n n V = Σv i = aΣI i i = 1 i = 1 Geïntegreerde intensiteit is de som van de intensiteit waarden van alle pixels ingesloten door feature, vermenigvuldigd met de oppervlakte van de cirkel / rechthoek (count mm 2). Daarom is de geïntegreerde intensiteit = a (ΣI i – b) Hier, b staat voor het gemiddelde voor de achtergrond pixel intensiteit. Deze formule berekent de geïntegreerde signaal intensiteiten van de controle of experimentele putjes en daardoor stelt een standaardmethode curve. Virale titers in de testmonsters werden berekend met deze standaard curve. Concentratie (van intensiteit) wordt gedefinieerd als de hoeveelheid fluorescentie aanwezig in een gedefinieerde ROI. De concentraties in de monsters zijn berekeningTed ten opzichte van de vastgestelde concentraties van de normen in de afbeelding. Om de precieze virale titers berekenen wordt de intensiteit van elke concentratie standaard uitgezet en voorzien met een lange interpolatie curve. De concentraties van de proefmonsters berekend door vergelijking van de intensiteit van het gebied binnen de standaardcurve. Bepaling van virale titers uit BAL vloeistof van influenza geïnfecteerde muizen Detectie van levende influenza virusdeeltjes in klinische en laboratorium monsters is van cruciale betekenis. Daarom we next onderzocht of we kunnen deze methode gebruiken om de virale titers in laboratoriummonsters bepalen. BAL vloeistoffen werden verzameld uit niet-geïmmuniseerde muizen en verrijkt met een bekende hoeveelheid van PR8 virus. Spiked BAL vloeistoffen werden lineair getitreerd voor het opsommen van de virale titers. Aliquots van spiked BAL vloeistoffen werden gebruikt om MDCK cellen te infecteren in 96-well platen, gefixeerd en gekleurd met anti-M2 en IR dye-geconjugeerd secondary antilichamen. Resultaten weergegeven in figuur 3A aantonen dat de virale titers in de spiked BAL vloeistof detecteerbare waren en gecorreleerd met de PR8 titers in de standaard curve. Met de standaardcurve, werd precieze virale getallen in de gespiked en getitreerd BAL vloeistof gekwantificeerd. Exponentiële curve fit berekeningen van een maatregel om de virale titers in het verrijkte BAL vloeistof (Figuur 3B) te berekenen. Door middel van deze methode kregen we een uitstekende correlaties tussen de berekende en verrijkt virale titers, het valideren van deze aanpak (Figuur 3C). Vervolgens analyseerden we de BAL-vloeistof van PR8-geïnfecteerde muizen. PR8 is veelvuldig gebruikt in muismodellen voor de menselijke pathologie en anti-virale immuniteit 3 te begrijpen. Groepen van muizen werden intranasaal geïnfecteerd met 5.000 PFU van PR8. Muizen werden gevolgd om gewicht te verliezen, het uiterlijk van de gebochelde rug, gegolfde vacht en andere klinische symptomen. Op dagen 0, 2, 4, 7 en 10 van na infectie,muizen werden opgeofferd en BAL vloeistoffen werden verzameld. Om deze laboratoriummonsters benutten, werden MDCK cellen geïncubeerd met seriële verdunningen van BAL vloeistof in een eindvolume van 50 ul voor 17 h in 96-well platen. Controle putten van MDCK cellen geïnfecteerd met bekende titers op voorraad PR8 virus diende om een ​​standaard curve te genereren. Na infectie werden cellen gewassen, gefixeerd en gekleurd met anti-M2 primaire antilichaam gevolgd door near-IR dye-geconjugeerd secundair antilichaam. MDCK cellen die waren mock-geïnfecteerd of behandeld met isotype controles na de besmetting op voorwaarde dat de achtergrond fluorescentie intensiteiten voor titer berekeningen. Analyses van de BAL vloeistof aangetoond dat PR8 virus in het laboratorium specimen wordt detecteerbaar via de IR dye-based assay systeem. Een aanzienlijke stijging van het viral load in de BAL vloeistof werd waargenomen op dagen 2 en 4 post infectie (Figuur 4A). Berekeningen van de geïntegreerde intensiteit aangegeven dat BAL vocht van dag 2 en 4 van i plaatsennfection bevatte aanzienlijke niveaus van PR8 virus (Figuur 4B). Onze resultaten tonen een geleidelijke maar significante gewichtsverlies tijdens de vroege fase van PR8 infectie, het aantonen van de ernst van de ziekte. Niettemin meeste muizen begon herstellen van ziektesymptomen en gewichtstoename 7 dagen na infectie (Figuur 4C). Muizen op dag 10 na infectie ontbrak enige mogelijke PR8 met vermelding van de klaring van het virus, die ook samen met de toename van het lichaamsgewicht en een aanzienlijke vermindering van de symptomen van de ziekte. Om verdere uitbreiding van de toepassing van deze test, testten we een 2009 A (H1N1) griep bij de mens te isoleren met IR op dye-basis antilichaam detectie systeem en vergeleek het met real-time PCR-test. Deze klinische steekproef werd geïsoleerd uit een gecombineerde nasofaryngeale / keeluitstrijkje verkregen van verdachte patiënt. Het isoleren werd gekweekt in MDCK cellijn op de Milwaukee Health Department Laboratory. De testresultaten waren bedrijvenrood naar de gevoeligheid van de IR kleurstof gebaseerde methode om real-time PCR assays (figuur 5) te controleren. De resultaten geven aan dat de IR kleurstof-based antilichaam detectiesysteem het potentieel om viral load detecteren zo laag als 10 3 TCID 50 / ml, die vergelijkbaar zijn met PCR-gebaseerde test (10 TCID 50 / ml) en vallen binnen de klinische relevantie heeft voor de meeste patiënten monsters. Deze resultaten geven sterke aanwijzingen dat de IR-dye-gebaseerde test systeem voldoende gevoeligheid en potentieel om te worden toegepast voor virale titer opsomming in research laboratorium en klinische settings heeft. Figuur 1. IR op dye-basis immuun detectie van het influenza virus. (A) Confocale microscopische analyses van influenza-geïnfecteerde MDCK cellen in 8-kamer en dia's. Immunofluorescentie microscopische analyses laten zien van het aanhangend MDCK monolaag is grotendeels intact en geladen met virus-afgeleide M2 eiwit. (BC) Kwantificering van de virale titers op basis van IR-kleurstof en LI-COR Odyssey-systeem. (D) generatie van de standaard bochten en exponentiële curve-fit profielen. Gegevens in het jaar zijn representatief voor vijf onafhankelijke experimenten. Figuur 2. Methodologie van het bepalen van virale titers met behulp van IR-kleurstoffen. (A) Geïntegreerde fluorescentie-intensiteit metingen. Een bepaald gebied binnen de test putten (ROI) stond in het teken van de fluorescentie-intensiteiten te meten. Automatische Shape Tool, werden grenzen van de ROI getrokken in het midden van de test wells van 96 – of 384-wells platen. Fluorescentie werd gemeten als de individuele pixels (pixel = n) binnen de ROI. Geïntegreerde intensiteit is de som van de intensiteit waarden van alle pixels ingesloten door feature, vermenigvuldigd met de oppervlakte van de cirkel / rechthoek (count mm 2). (B) Het bepalen van de geïntegreerde fluorescentie-intensiteiten in assay putten. Oprichting van ROIkon de LI-COR scanner aan op de gedefinieerde achtergrond putten te vergelijken met het virus getitreerd monsters. Achtergrond fluorescentie werd gekwantificeerd van de mock-geïnfecteerde of secundaire antilichaam alleen controles en gebruikt om de geïntegreerde intensiteit in de test putten te schatten. (C) Het verzamelen van data punten binnen de ROI. Twee tegengestelde dradenkruis (wit) geïntroduceerd binnen de ROI van de intensiteit van fluorescentie te meten in de put. Curves naar de rechterkant en onder de vertegenwoordiger putjes zijn de intensiteit van de pixels langs deze dradenkruis. Figuur 3. Detectie en kwantificering van virus titers in PR8 spiked BAL vloeistoffen. (A) MDCK cellen werden gekweekt in 96-well plaatjes gedurende een nacht en toegevoegd met PR8-spiked BAL vloeistof. Platen werden gelezen in de LI-COR Odyssey-systeem. (B) exogeen spiked BAL vloeistof werd in vergelijking met standaard bochten. (C) Vergelijking van berekende verwachte vir al titers. Exponentiële curve fitting voorzien y = 9.4784e 0.0014x. Data gepresenteerd in AC zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten. Figuur 4. Detectie en kwantificering van influenza virus in BAL vocht uit PR8 geïnfecteerde muizen. (A) Groepen van muizen werden intranasaal geïnfecteerd met 5.000 PFU van PR8. MDCK cellen werden geïncubeerd met seriële verdunningen van BAL vloeistof in een eindvolume van 50 ul voor 17 h in 96-well platen. Na infectie werden cellen gewassen, gefixeerd en gekleurd met anti-M2 primaire antilichaam gevolgd door IR dye-geconjugeerd secundair antilichaam. De meest rechtse paneel staat voor de standaard curve. (B) Kwantificering van virale titers in de BAL vloeistof van geïnfecteerde muizen. (C) verlies van het gewicht van muizen tijdens PR8 infectie gecorreleerd met de viral load. Data gepresenteerd in AC zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten. re 5 "src =" / files/ftp_upload/3623/3623fig5.jpg "/> Figuur 5. Detectie en kwantificering van 2009 A (H1N1) pandemie (PDM) influenza isoleren van een menselijke patiënt. (A) De IR op dye-basis antilichaam fluorescentiesysteem detectie voor half-voudige titratie van geïnfecteerde MDCK cellijn. De fluorescentie resultaten wijzen op het assay heeft potentieel om viral load detecteren zo laag als 10 3 TCID 50 / ml. (B) Nucleïnezuur uit cultuur samen isoleren met een seriële tienvoudige verdunningen van een bekende getitreerd H1N1 isolaat werden geanalyseerd met het CDC real-time PCR-test 12. Detectielimiet voor real-time PCR was 10 TCID 50 / ml.