Herstellung von Tissue Microarrays, Immunhistochemie Färbung und Digitalisierung Innerhalb des Human Protein Atlas

1. Wie man Gewebe für Tissue Microarray Produktion vorzubereiten (Animation 1) Wählen Sie relevanten Formalin-fixierten Paraffin eingebetteten Material (Gewebe-oder Zellproben) einschließlich entsprechender Hämatoxylin gefärbter Gewebeschnitt. Markieren Sie relevanten Bereich auf dem Gewebeschnitt. Es wird empfohlen, einen frisch geschnittenen Hämatoxylin Schnitt entsprechend der Paraffin-Block haben. Gestalten Sie die Vorlage für die TMA-Produktion verwendet. Randomize die Proben in der Vorlage, um Artefakte durch technische Probleme wie zum Beispiel Abdeckung des Antikörpers über den gesamten Abschnitt TMA und Schneiden Probleme zu vermeiden. Fügen Sie zusätzliche Marker Orientierung an der Vorlage zur Orientierung. Organisieren Sie die Gewebe nach der Vorlage. 2. Manuelle Gewebe-Mikroarray Produktion (wesentlich für Dreharbeiten) Um eine einheitliche Länge der Gewebe-Kerne zu erhalten, markieren Sie den Mandrin zB 4,5 mm (Abbildung 2). GuidelInes für Abstand zwischen Probe-Zentren: Kerngröße 0,6 mm – 0,8 bis 1,0 mm Kerngröße 1,0 mm – 1,8 bis 2,0 mm Kerngröße 1,5 mm – 2,0 bis 3,0 mm Kerngröße 2,0 mm – 2,5 bis 4,0 mm Es wird empfohlen, 2,5 bis 3,0 mm-Rändern auf jeder Seite des Paraffin-Blocks verlassen, um Rissbildung des Paraffins. Montieren Sie die ausgewählten Schläge verwendet werden. Starten Sie durch Lösen der Innensechskant Schrauben, die den Stempel in Position hält. Der Stempel korrekt positioniert ist, wenn die Nut des Stempels Nabe fest gegen die Metallstange in der Kunststoff-V-Block angeordnet. Ziehen Sie die Schrauben und stellen Sie sicher, dass der Rand des Metall-Clip horizontal ist. Der Empfänger Punsch (grün markiert und rot, die spezifisch für Händler) sollte auf der linken Seite platziert werden. Die Spenderstanze (markiert mit Grün und Blau, die spezifisch für Distributor), die einen geringfügig größeren Durchmesser hat, sollte auf der rechten Seite platziert werden (Abb. 3). Verschieben Sie die Schläge entlang der x-und y-Achsen mit Hilfe der XY-Einstellknöpfe. Die richtige Ausrichtung Knopf bewegt die Stempel entlang der x-Achse und der linke Verstellknopf bewegt die Stempel entlang der y-Achse. Es gibt ein digitales Mikrometer Anzeige auf beiden Einstellknöpfe. Diese werden aktiviert, wenn die Knöpfe bewegen. Zurücksetzen → drücken Sie die ZERO / ABS-Taste. Umschalttaste zwischen Zoll und mm → Drücken Sie die IN / mm drücken. Der Raum zwischen den Löchern sollte 2,0 mm (gemessen zwischen den Zentren der Löcher) bei Verwendung einer 1 mm Stempels für einen 9×8-Vorlage. Um sicherzustellen, dass Sie nicht drücken Sie den Stempel zu weit nach unten in den Block, Schlagen Sie die Kassette und die Zerstörung der Punsch, lege eine Kassette ohne Paraffin in der Halterung und stellen Sie die untere Position des Empfängers Punsch bis 1 mm über dem Boden der Kassette mit der Tiefe an der Anschlagschraubeoberen linken Ecke des Z-Führung (Abbildung 3). Legen Sie die Empfänger-Block in der Halterung und verwenden Sie den kleinsten Schraubendreher, um die Schrauben zu befestigen. Sind die Schrauben nicht zu eng oder das Paraffin könnte ausbrechen aus der Kassette. Schieben Sie den Empfänger Punsch nach unten ca. 5 mm in den Empfänger-Block und mit dem Handgriff in der Stanze, um den Stempel hin und her drehen, einmal (Abbildung 3). Das Loch wird 5 mm tief beim Schieben des Stempels so weit unten in den Block wie möglich. Entlasten Sie den Druck langsam nach unten schieben, so dass die Federn kann der Stempel nach oben. Verwenden Sie den Führungsstab der Locherabfall und entsorgen Sie die Paraffin-Kern. Bewegen Sie den Revolver in der Spenderstanze (Abbildung 3) zu wechseln. Platzieren Sie die Donorblock Brücke mit dem Donorblock über dem Empfängerblock (Abb. 3). Schieben Sie den Spender punch in den ausgewählten Bereich des Donorblocks. Verwenden Sie einen entsprechenden Hämatoxylin und Eosin gefärbten Objektträger, wo die Region von Interesse markiert wurde, um das Gewebe, die zu beproben als es zu lokalisieren. Manuelles Halten Sie die Donorblock in Position mit der linken Hand und drücken Sie den Stempel mit der rechten Hand. Beachten Sie, dass Sie sollten nicht auf dem Stilett zu schieben. Der Tiefenanschlag blockiert nicht den Stempel Bewegung an der richtigen Position für den Spender-Block, so ist es wichtig, dass Sie aufhören zu drängen, wenn das zweite Zeichen ist sichtbar auf dem Stilett. Drehen Sie den Griff auf dem Stempel einmal (Abbildung 3). Langsam den Druck nach unten während Sie die Halterung auf der Donorblock Donorblock Brücke. Das Spendergewebe wird vorzugsweise 0,5 mm kürzer als der Empfänger Kern ausgestanzt. Dieser Prozess wird eine einstellbare Ausrichtung der Kerne auf dem Empfängerblock Oberfläche zu gewährleisten, zu vermeiden Verlust wertvoller repräsentativen Gewebe. Entfernen Sie die Brücke und die Donorblock. Machensicher, dass die Spenderstanze mit dem Loch, das früher gemacht wurde (Punkt 4) ausgerichtet ist. Sie müssen passen Sie die Lochposition mit den Stellschrauben, wenn der Spender Punsch und das Loch in der Empfänger-Block nicht ausgerichtet sind. Schieben Sie den Stempel nach unten, bis seine Spitze erreicht die Spitze des Loches in dem Empfänger-Block. Halten Sie diese Position, verwenden Sie den Mandrin, um das Gewebe Kern in das Loch zu leeren. Die Kernoberfläche sollte in Ausrichtung mit dem Block Fläche sein. Bewegen Sie den Revolver zurück an den Empfänger Punsch. Bewegen Sie die nächste Position mit den XY-Einstellknöpfe. Wiederholen von Punkt 4c oben, bis das Array abgeschlossen ist. Wenn die ganze Rezipientenblock beendet ist, lösen Sie die Schrauben in den Empfänger-Halter. Backen Sie den Block in 42 ° C für 40 Minuten. Legen Sie den Block mit dem Schneiden Bereich nach unten auf einen Objektträger aus Glas. Legen Sie den Objektträger aus Glas mit dem Block auf der Spitze eines Probenröhrchenhalter (oder andere geeignete Konstruktion) und in ter Ofen. Nach dem Backen, entfernen Sie das Reagenzglas Halter aus dem Ofen und glätten die Oberfläche des Blocks durch sanftes Streicheln der Objektträger aus Glas. Den Block mit dem Glasträger auf einer Kühlplatte für 10 Minuten. Um repräsentative Gewebe während der TMA gewährleisten eine Qualitätskontrolle auf jeder 50-jährigen Abschnitt durchgeführt wird. 3. Wie in Abschnitt TMAs (Animation 2) Schneiden Sie 4 um dicke Schnitte mit Hilfe eines Mikrotoms mit Abschnitt Transfer System (HM 355S, Microm). Das System kann mit allen gängigen Rotationsmikrotome verwendet werden. Das System besteht aus einem Schlitten mit integrierter Überladebrücke, einem erwärmten Wasserbad und einer Steuereinheit. Von der Klinge gleiten die Abschnitte auf der nassen Oberfläche Übertragung über einen Transfer Brücke in das Wasserbad. Die Abschnitte sollen aus dem Wasserbad genommen werden unmittelbar nach ihrer ausgestreckt, um das Schmelzen von empfindlichem Gewebe Flecken (zB fetthaltiges Gewebe wie Brust und Gehirn) zu vermeiden. Place der Abschnitt auf einem SuperFrost Objektträger aus Glas. Die Zeit, die Abschnitte im Wasser verbleiben kann, hängt von der Art des Paraffin gewachst verwendet und die Wassertemperatur. Unser Labor Verwendung von Paraffin Histolab Products AB, das einen Schmelzpunkt von 56-58 ° C und wir empfehlen eine Wasserbadtemperatur von 37-39 ° C haben Legen Sie die Folien in einer Diahalter für die Trocknung bei Raumtemperatur (RT) über Nacht. Die Objektträger werden bei 50 ° C für 12-24 Stunden gebacken. Mit einem Mikrotom ohne STS müssen Sie den Abschnitt von der Klinge in ein Wasserbad manuell mit zB einer Bürste zu transportieren. 4. Test-und Titrationsverfahren zur Immunhistochemie (Animation 3) Jeder Antikörper an einem standardisierten Testverfahren unter Verwendung speziell gestalteter TMA, die eine Mischung von Geweben und Zelltypen unterzogen. Das Ziel ist es, eine individuelle und optimierte Immunfärbung Protokoll für jeden Antikörper zu bewerten. Zunächst eine Verdünnung, auf Basis von Ameiseibody Stoffkonzentration der dem primären Antikörper getestet. Das Ergebnis dieses Tests Färbung wird verwendet, um weitere Verdünnungen und Optimierung des Protokolls zu führen. Entparaffinierung und Rehydrierung in Xylol und abgestuften Ethanol zu destilliertem Wasser vor der Immunfärbung durchgeführt. Eine Sperrung Schritt, um endogene Peroxidase zu stillen wird in 0,3% H 2 O 2 in 95% Ethanol für 5 Minuten durchgeführt. Hitze Induzierte Epitop Wiedergewinnung (HIER) ist in einem Retrieval-Puffer pH 6 durchgeführt, mit einem Druckkessel (enttarnen Kammer Biocare Medical) als Wärmequelle für 4 Minuten bei 125 ° C Nach Abschluss Kochen, bleiben Folien in der Druck-Kessel und dürfen bis 90 ° C abkühlen Die gesamte Bearbeitungszeit für das HIER ist ca. 45 Minuten. Wenn kein schlüssiges Ergebnis im ersten Test erhalten wird, werden weitere Tests auf der Basis der beobachteten Färbemuster 5 6 getan. Eine Pilotstudie, in der HPA High-Throughput-Set-up, zeigte, die die nützlichsten Antigen-Retrieval, wo HIER pH 6, aber auch andere Suchverfahren wie Pre-Inkubation mit Proteinase, Mikrowelle und siedet in Puffer mit höheren oder niedrigeren pH natürlich verwendet werden. Durch die Änderung der IHC Bedingung zB Wechsel Antikörper Inkubationszeiten, Antikörperverdünnungen und Diaminobenzidin (DAB) Inkubationszeiten das Färbungsmuster geben kann mehr schlüssige Ergebnisse. 5. Färbung Programm, Autostainer 480 (Thermo Fisher Scientific) Alle Inkubationen werden bei RT durchgeführt und dieses Protokoll kann auch in ein manuelles Setup mit den gleichen Reagenzien verwendet werden. Spülen in Waschpuffer. Die Inkubation mit Ultra-V-Block für 5 Minuten. Spülen in Waschpuffer. Inkubation mit dem primären Antikörper für 30 Minuten. Spülen in Waschpuffer (x2). Inkubation mit Meerrettich-Peroxidase markierten-Polymer für 30 Minuten. Spülen in Waschpuffer (x2). Die Entwicklung in DAB-Lösungfür 10 Minuten. Spülen in Waschpuffer (x2). Gegenfärbung in Mayers Hämatoxylin für 5 Minuten *. Bei Verwendung eines progressiven Färbemethode (zB Mayers Hämatoxylin) Die Intensität hängt von Zeit und keine Differenzierung erforderlich ist. Eine regressive Färbemethode z. B. Harris Hämatoxylin erfordert Differenzierung, um überschüssige Farbstoff aus dem Gewebe zu entfernen, um eine Struktur akzentuieren. Spülen in Leitungswasser *. Spülen Sie in Lithiumcarbonat Wasser 1:5 verdünnt aus gesättigten Lösung für 1 Minute *. Spülen in Leitungswasser für 5 Minuten *. Die Folien sind dehydriert in abgestuften Ethanol und Dias werden mit einem Deckglas (PERTEX, Histolab) Alle Reagenzien werden bei einem Volumen von 300 ul pro Objektträger aufgetragen. * Die Schritte 10-14 werden in einem histostaining Instrument (Autostainer XL, Leica) getan und Eindecken ist zusätzlich in einem Eindecker-System (Automated Glas-Eindecker CV5030, Leica) durchgeführt. 6. Vorgehensweise beim Scannena Schieben Das Verfahren Scannen von Dias ist abhängig von der digitalen Scanner ausgenutzt wurde dieses Protokoll nur definiert, wie eine Folie über das automatisierte Scannen System Aperio XT (Aperio Technologies) zu scannen. In der Human Protein Atlas Aufbau 20-facher Vergrößerung für das Gewebe und 40x für die Zellen verwendet werden. Automatisiertes Scannen könnte auftreten Fokus-Probleme aufgrund der Heterogenität des Gewebes und die Anzahl der verschiedenen Geweben in einem TMA enthalten. Reinigen Sie den Objektträger aus Glas von Schmutz, Kleber und prüfen Sie, ob Luftblasen zwischen dem Deckglas und dem Abschnitt. Im Falle von Luftblasen remount der Schieber. Legen Sie die Folie in einem Rack und legen die Zahnstange in der digitalen Scanner. Die Zeit, um einen TMA bei 20-facher Vergrößerung zu scannen beträgt ca. 6 Minuten. Eine Software von Aperio wird verwendet, um Interessengebiet auszuwählen. Fokuspunkt Auswahl wird automatisch in der Software gemacht. Manuelles Auswahl des Scan-Bereichs und Schwerpunkte ist ebenfalls möglich. Nachdem das Bild hso generiert wurde, kann für die Auswertung und Kommentierung der IHC-Färbung verwendet werden. Die Bilder bleiben als Ergebnis des Experiments Datei und kann den Kollegen für Gespräche verteilt werden und weitere für die Veröffentlichung der Daten verwendet wird. Die Bilder können in einem frei verfügbaren Software durch Aperio angesehen werden. 7. Wie Sie für Ihre Lieblings-Protein in der Human Protein Atlas Suche Navigieren Sie zu www.proteinatlas.org. Geben Sie den Namen Ihres Lieblings-Protein, Ensembl id, UniProt Zugangsnummer oder HGNC Namen zB Insulin. Geben Sie die Übersichtsseite und scrollen Sie zum normalen Gewebe-und Organersatz Zusammenfassung. Die Übersicht zeigt die Proteinexpression in der Bauchspeicheldrüse. Klicken Sie auf "mehr Gewebe Daten". Sie betreten das normale Gewebe sehen, wo Sie sehen können alle Gewebe durch Orgel gehörten sortiert. Klicken Sie auf Bauchspeicheldrüse, um die Ergebnisse für IHC 3-Antikörper auf das gleiche Protein gerichtet zu sehen. Um einen hallo ansehenGH-Auflösung von Pankreas Klick auf das Bild. Zusätzliche Hinweise zur Proteinexpression in Krebsgewebe, Zellen und eine weitere Validierung von Daten innerhalb des Human Protein Atlas kann durch Durchsuchen des Human Protein Atlas Website gefunden werden. 8. Repräsentative Ergebnisse Animation 1. Wie man Gewebe für Gewebe-Mikroarray Produktion vorzubereiten. Klicken Sie hier um Animation 1 sehen . Animation 2. Wie Abschnitt TMAs. Klicken Sie hier um Animation 2 anzuzeigen . Animation 3. Die Immunhistochemie Technik beschrieben wird. Klicken Sie hier, um die Animation 3 sehen . Abbildung 1. Allgemeine Systematik des Prozesses innerhalb des Human Protein Atlas Uppsala. Abbildung 2. Donor Mandrin für standardisierte Länge von Gewebe Kerne markiert zB 4,5 mm. Abbildung 3. Manuelle Gewebe Microarrayer. Abbildung 4. Beispiele für unterschiedliche Qualität der produzierten TMAs. (A) eine gerade übereinander TMA mit ausreichend Platz zwischen den Zeilen und Spalten als auch an den Rand des Paraffins. (B) einer TMA mit einigen der Kerne zu nahe am Rand was wahrscheinlich Schwierigkeiten beim Schneiden zu schließen. (C) eine TMA, die seit t gebackenoo lange was zu einer eingestürzten TMA ohne die richtige Vorlage. Abbildung 5. Hämatoxylin und Eosin gefärbt TMAs. (A) Ein richtig geschnitten mit geradem Schnitt und ausgerichtet Spalten und Zeilen. Mit einem schlecht oder schmutzig Klinge konnte in Splitting (B) oder komprimierte Abschnitte (C) führen. Abbildung 6. Titration von Antikörpern. (A) Reaktionszentrum Zellen in Lymphknoten zeigt eine optimal titriert Antikörper, was zu einer spezifischen zytoplasmatische (gezeigt in braun) ohne Hintergrund. (B) Der Gewebeschnitt zeigt schwache Färbung. Negative oder eine schwache Färbung gefunden wird, wenn die Konzentration des primären Antikörpers zu niedrig ist oder das Zielprotein nicht in den immunogefärbten Gewebe. (C) der Gewebeschnitt ist überfärbt aufgrund einer zu hohen Konzentration des primären Antikörpers zu verwenden. Das dArche Farbe führt zu Schwierigkeiten Bestimmung der subzellulären Ort durch überschwappen, Kreuzreaktivität und falsche Positivität.