Produção de Microarrays Tecido, de coloração imuno-histoquímica e de digitalização Dentro do Atlas proteína humana

1. Como se preparar tecidos para a produção de tissue microarray (Animação 1) Selecionar material de parafina relevante formalina fixo incorporado (amostras de tecidos ou células), incluindo correspondente secção de tecido manchado hematoxilina. Marcar área relevante na secção de tecido. Recomenda-se a ter uma secção corada com hematoxilina acabada de cortar correspondente ao bloco de parafina. Projete o modelo usado para a produção de TMA. Randomize as amostras dentro do modelo para evitar artefatos causados ​​por problemas técnicos, tais como cobertura do anticorpo sobre a seção TMA todo e problemas de seccionamento. Adicionar marcadores de orientação adicionais para o modelo para orientação. Organizar os tecidos de acordo com o modelo. 2. Produção Microarray manual de Tissue (essencial para a filmagem) Para ser capaz de obter um comprimento normalizado de os fragmentos de tecido, marcar o estilete 4,5 milímetros por exemplo, (Figura 2). Guidelines para o espaçamento entre os centros de exemplo: núcleo de tamanho 0,6 milímetros – 0,8-1,0 milímetros núcleo milímetros de tamanho 1.0 – 1,8-2,0 mm núcleo de tamanho 1,5 milímetros – 2,0-3,0 milímetros núcleo tamanho 2,0 milímetros – 2,5-4,0 milímetros Recomenda-se para deixar 2,5-3,0 margens mm em cada lado do bloco de parafina para evitar rachaduras da parafina. Monte os socos selecionado para ser usado. Comece por afrouxar os parafusos da chave sextavada que prende o soco no lugar. O punção é correctamente posicionada, quando a ranhura no cubo punção é colocado firmemente contra a haste de metal no plástico v-bloco. Apertar os parafusos e certificar-se que a borda do clipe de metal é horizontal. O soco destinatário (marcados em verde e vermelho, específico para o distribuidor) deve ser colocado para a esquerda. O perfurador dador (marcado em verde e azul, específico para o distribuidor), que tem um diâmetro ligeiramente maior, deve ser colocado para a direita (Figura 3). Mova os socos ao longo dos x e y eixos usando os botões de ajuste XY. O botão de ajuste direita move os socos ao longo do eixo-x e o botão de ajuste esquerdo move os socos ao longo do eixo y. Existe uma leitura digital na micrómetro botões tanto de ajustamento. Estes são ativados quando se deslocam os botões. Redefinir → pressione o botão ZERO / ABS. Mudança entre polegadas e mm → pressione o botão IN / mm. O espaço entre os furos deve ser de 2,0 mm (medido entre os centros dos furos) quando se utiliza um perfurador 1 mm para um modelo de 9×8. Para garantir que não empurrar o soco demasiado baixo para dentro do bloco, atingindo a cassete e destruir o soco, colocar uma cassete sem parafina no suporte e definir a posição inferior da punção receptora a 1 mm acima da parte inferior da cassete usando o parafuso batente de profundidade nacanto esquerdo superior da guia de Z-(Figura 3). Colocar o bloco receptor no suporte e usar o menor chave de parafusos para fixar os parafusos. Não aperte os parafusos apertados ou a parafina pode libertar-se da cassete. Empurrar o perfurador destinatário para baixo cerca de 5 mm para dentro do bloco receptor e usar o identificador no soco para girar o perfurador para trás e para a frente uma vez (Figura 3). O orifício será de 5 mm de profundidade ao empurrar o soco, tanto para baixo para dentro do bloco quanto possível. Aliviar a pressão descendente empurrando lentamente, de modo que as molas podem mover o perfurador para cima. Use o estilete para esvaziar o soco e descartar o núcleo de parafina. Mover a torre para mudar para o dador perfurador (Figura 3). Coloque a ponte bloco dador com o bloco dador sobre o suporte de bloco receptor (Figura 3). Empurre a punção de doadoresh para a área seleccionada do bloco dador. Usar uma hematoxilina e eosina correspondente lâmina corada onde a região de interesse foi marcado para localizar o tecido que está a ser amostrado. Manualmente segurar o bloco de doadores na posição com a mão esquerda e empurre o soco com a mão direita. Note que você não deve empurrar o estilete. O limitador de profundidade não bloqueia o movimento perfurador na posição apropriada para o bloco dador, por isso, é importante que pára de empurrar quando a segunda marca é visível na estilete. Rodar a pega do perfurador uma vez (Figura 3). Lentamente, liberte a pressão para baixo enquanto mantém o bloco de doadores na ponte bloco doador. O tecido do dador é de preferência perfurado 0,5 milímetros mais curto do que o núcleo do destinatário. Este processo irá garantir um alinhamento ajustável dos núcleos na superfície bloco receptor, evitando a perda de tecido representativo valioso. Remover a ponte e do bloco dador. Fazercerteza de que o doador perfurador é alinhado com o furo que foi feita anteriormente (ponto 4). É necessário ajustar a posição de perfuração utilizando os parafusos de fixação se o perfurador dador e do orifício no bloco receptor não estão alinhados. Cuidadosamente empurrar o perfurador para baixo até que a sua ponta atinge o topo do furo no bloco receptor. Mantendo esta posição, usar o estilete para esvaziar o núcleo tecido dentro do buraco. A superfície do núcleo deve estar em alinhamento com a superfície do bloco. Mova o revólver de volta para o soco destinatário. Mova para a posição seguinte com os botões de ajuste XY. Repita a partir do ponto 4c acima até que a matriz está completa. Quando o bloco receptor inteiro tenha terminado, desapertar os parafusos no suporte do bloco receptor. Coza no bloco em 42 ° C durante 40 minutos. Colocar o bloco com a área de corte voltado para baixo sobre uma lâmina de vidro. Coloque a lâmina de vidro com o bloco no topo de um suporte de tubos de ensaio (ou a construção apropriada outro) e colocar em tele forno. Após o cozimento, remover o suporte do tubo de ensaio do forno e achatar a superfície do bloco suavemente alisando a lâmina de vidro. Colocar o bloco com a lâmina de vidro sobre uma placa de arrefecimento durante 10 minutos. Para garantir tecido representativo em todo o TMA um controle de qualidade em cada seção 50 º é realizada. 3. Como TMAs Seção (Animação 2) Corte 4 mm de espessura usando um micrótomo com sistema de transferência de seção (HM 355S, Microm). O sistema pode ser usado com todos os actuais micrótomos rotativos. O sistema é composto por um transportador de lâmina com ponte de transferência integrado, um banho de água aquecida e uma unidade de controlo. A partir da lâmina as secções deslizar sobre a superfície de transferência de molhada através de uma ponte de transferência para o banho de água. As secções devem ser tomadas a partir do banho de água imediatamente depois de terem esticados para fora, para evitar a fusão das manchas de tecidos sensíveis (ex. tecidos lipídicos ricos como da mama e do cérebro). Place a seção sobre uma lâmina de vidro SuperFrost. O tempo das secções pode ser deixado na água depende do tipo de parafina encerado utilizado e da temperatura da água. O nosso laboratório cera de parafina utilização a partir de HistoLab Products AB, que têm um ponto de fusão de 56-58 ° C e recomendamos uma temperatura de banho de água de 37-39 ° C. Colocar as lâminas no porta-lâminas para a secagem à temperatura ambiente (RT) durante a noite. As lâminas são cozidos em 50 ° C durante 12-24 horas. Usando um microtom sem STS que tem de transportar a secção da lâmina para um banho de água manualmente utilizando, por exemplo uma escova. 4. Teste e procedimento de titulação de imuno-histoquímica (Animação 3) Cada anticorpo é submetido a um procedimento de ensaio normalizado utilizando especialmente concebidos TMAs contendo uma mistura de tecidos e tipos de células diferentes. O objetivo é avaliar um protocolo de imunomarcação individual e otimizada para cada anticorpo. Inicialmente diluição um, com base em formigaiBODY concentração estoque do anticorpo primário é testada. O resultado deste teste de coloração é usado para guiar as diluições posteriores e optimização do protocolo. Desparafinização e hidratação em etanol xileno e graduada para a água destilada são realizadas antes da imunocoloração. Um passo de bloqueio para extinguir a peroxidase endógena é realizada em 0,3% de H2O 2 em etanol a 95% durante 5 minutos. Induzido pelo calor Epitope Recuperação (HIER) é realizada de um tampão de recuperação 6 pH, utilizando uma caldeira de pressão (câmara de Decloaking, Biocare Médico) como fonte de calor durante 4 minutos a 125 ° C. Depois de completada a ferver, as lâminas permanecem na caldeira de pressão e são deixados arrefecer até 90 ° C. O tempo total de processamento para HIER é de aproximadamente 45 minutos. Se nenhum resultado conclusivo é obtido no teste inicial, outros testes são feitos com base no padrão de coloração observada 5 6. Um estudo piloto, dentro do HPA de alto rendimento set-up, mostrouque a recuperação de antigénio mais útil onde HIER pH 6, mas outros métodos de recuperação, tais como pré-incubação com microondas proteinase, e destila em tampão com pH mais alto ou mais baixo pode, evidentemente, ser usado. Ao alterar a condição de IHC por exemplo, tempos de mudança de anticorpos de incubação, diluições e tempos de diaminobenzidina (DAB) de incubação do padrão de coloração pode dar resultados mais conclusivos. 5. Programa de coloração, Autostainer 480 (Thermo Fisher Scientific) Todas as incubações são realizadas à temperatura ambiente e este protocolo pode também ser utilizado como um instalação manual com os mesmos reagentes. Lavar em tampão de lavagem. A incubação com o bloco V Ultra durante 5 minutos. Lavar em tampão de lavagem. A incubação com anticorpo primário durante 30 minutos. Lavar em tampão de lavagem (x2). A incubação com peroxidase de rábano rotulado polímero durante 30 minutos. Lavar em tampão de lavagem (x2). Desenvolver em solução DABdurante 10 minutos. Lavar em tampão de lavagem (x2). Contracoloração em hematoxilina Mayers para 5 * minutos. Quando se utiliza um método de coloração progressiva (por exemplo Mayers hematoxilina) a intensidade depende do tempo e não é necessária a diferenciação. Um método de coloração regressiva por exemplo hematoxilina de Harris requer diferenciação para remover o excesso de corante dos tecidos, a fim de acentuar uma estrutura. Enxágüe com água da torneira *. Enxaguar em água de carbonato de lítio, diluído 1:5 a partir de uma solução saturada de 1 minuto *. Enxágüe em água corrente por 5 minutos *. As lâminas são desidratadas em etanol graduado e slides são as lamínulas (PERTEX, Histolab) Todos os reagentes são aplicados a um volume de 300 uL por lâmina. * Os Passos 10-14 são feitas em um instrumento histostaining (Autostainer XL, Leica) e lamínulas é adicionalmente feito em um sistema coverslipper (coverslipper vidro automatizada CV5030, Leica). 6. Como digitalizarum slide O método de lâminas de digitalização é dependente do scanner digital a ser utilizada, este protocolo apenas define como digitalizar uma lâmina utilizando o sistema de digitalização automatizada Aperio XT (Aperio Technologies). Na proteína Atlas Humano set-up ampliação de 20x para o tecido e 40x para as células são usadas. Digitalização automatizados poderiam encontrar problemas de focagem, devido à heterogeneidade do tecido e do número de diferentes tecidos e incluídos num TMA. Limpe a lâmina de vidro de cola, sujeira e verificar se há bolhas de ar entre as lamelas e da seção. Em caso de bolhas de ar remontar o slide. Coloque o slide em um rack e colocar o suporte no scanner digital. O tempo de varredura de uma TMA com ampliação de 20x é de aproximadamente 6 minutos. Um software de Aperio é usado para selecionar área de interesse. Seleção de ponto de foco é feito automaticamente dentro do software. Manualmente seleção de área de digitalização e pontos de foco também é possível. Após a imagem hcomo foi gerado pode ser usado para a avaliação e anotação da coloração IHC. As imagens permanecem como um arquivo de resultado da experiência e pode ser distribuído aos colegas para o debate, ainda utilizado para publicação dos dados. As imagens podem ser visualizadas em um software disponível gratuitamente Aperio. 7. Como procurar sua proteína favorita no Atlas proteína humana Navegue até www.proteinatlas.org. Digite o nome de sua proteína favorita, Ensembl ID, número de acesso UniProt ou insulina por exemplo HGNC nome. Entre na página de resumo e desloque-se para o tecido normal e resumo do órgão. A visão geral mostra a expressão da proteína no pâncreas. Clique em "mais dados de tecidos". Você entra nos tecidos normais ver onde você pode ver todos os tecidos incluídos ordenadas por órgão. Clique no pâncreas para ver os resultados da IHQ para 3 anticorpos dirigidos para a mesma proteína. Para visualizar um oigh-resolução de imagem de pâncreas clique na imagem. Mais informações sobre a expressão da proteína no tecido de câncer, as células e validação de dados complementares no Atlas Proteína humana pode ser encontrada pela procura da proteína humana website Atlas. 8. Os resultados representativos Animação 1. Como preparar os tecidos para a produção de tissue microarray. Clique aqui para ver uma animação . Animação 2. Como TMAs seção. Clique aqui para ver a animação 2 . 3 Animação. A técnica de imuno-histoquímica é descrito. Clique aqui para ver a animação 3 . Figura 1. Esquema geral do processo dentro da Human Protein Atlas Uppsala. Figura estilete Doador 2. Marcado para o comprimento normalizado de núcleos de tecidos, por exemplo, 4,5 mm. Figura 3. Microarrayer tecido Manual. Figura 4. Exemplos de qualidade diferente de TMAs produzidos. (A) Um. Recta e devidamente alinhados TMA com espaço suficiente entre as linhas e colunas, bem como para a borda da parafina (B) Um TMA com alguns dos núcleos demasiado perto da borda resultando em prováveis ​​dificuldades quando seccionamento. (C) Um TMA que tenham sido cozido para too tempo, resultando em uma TMA colapso sem o modelo correto. Figura 5. Hematoxilina e eosina TMAs. (A) Uma secção adequadamente cortadas com colunas rectas e alinhados e linhas. Usando uma lâmina mau ou suja pode resultar em divisão (B) ou secções comprimido (C). Figura 6. Titulação de anticorpos. (A) Reação células center em linfonodo mostra um anticorpo ideal titulada resultando em uma coloração específica citoplasmática (mostrado em castanho) sem fundo. (B) A secção de tecido mostra coloração fraca. Coloração negativa ou fraco é encontrado quando a concentração de anticorpo primário é demasiado baixa, ou se a proteína alvo não está presente nos tecidos imunocoradas. (C) A secção de tecido é overstained devido ao uso de concentração demasiado elevada do anticorpo primário. A dresultados de cores arca em dificuldades que determinam a localização subcelular devido a transbordar, reatividade cruzada e falsa positividade.