Spesifik genlerin aşırı ekspresyonu veya demonte sonra Ramos B Hücreleri somatik hipermutasyon Değerlendirilmesi
Summary
Biz aşırı ekspresyonu veya shRNA insan Ramos B-hücre hattı ve bu hücrelerin nasıl somatik hipermutasyon ölçmek için yapıları içeren. Retroviral veya lentiviral enfeksiyonları nasıl gerçekleştirileceği tarif
Abstract
V (D) J rekombinasyon tarafından oluşturulan düşük afinite antikorları B hücreleri ile onların yaşam başlar. Ancak, bir patojen tespit üzerine, immünglobulin (Ig) geninin değişken (V) bölgesinde yüksek afiniteli antikorlar 1,2, yaklaşık 100.000 kat daha fazla somatik hipermutasyon (SHM) ile genomun geri kalanından daha mutasyona uğramış olan. Buna ek olarak, sınıf anahtarı rekombinasyon (KSS), belirli bir patojen için gerekli olan immün yanıtın türüne bağlı olarak farklı efektör fonksiyonları ile antikor üretir. Hem KSS ve SHM uracils üretmek için DNA'da sitozin kalıntılarının deaminates aktivasyonla indüklenen sitidinin deaminaz (AID), tarafından başlatılan. Bu uracils sonuçta, mutasyon ve 1-3 rekombinasyon, tamir yollarının hata eğilimli formları tarafından işlenir .
SHM ve CSR moleküler ayrıntıları mevcut anlayış farelerde çalışmaların bir kombinasyonu gelen, birincil hücreler, hücre hatları ve hücre-free deneyler. Fare modelleri birçok onarım faktörler (örneğin UNG, Msh2, Msh6, Exo1 ve polimeraz η) 4-10 için kritik roller gösteren genetik tırnakları ile altın standart olmaya devam etmektedir. Ancak, bütün genleri nakavt çalışmaları için mükellef bulunmaktadır. Örneğin, birkaç çift iplikli sonu onarım proteinleri tırnakları embryonically ölümcül veya B-hücre gelişimi 11-14 bozar. Ayrıca, bazen SHM veya KSS bir proteinin belirli bir işlevi nakavt neden daha fazla küresel hasar maskelenmiş olabilir. Buna ek olarak, farelerde deneyler bu yana aday genler 15-18 tanımlanması ve karakterize hücre hatları tek tek genlerin ifadesi giderek daha popüler bir ilk adım haline gelmiştir değiştirerek, uzun süreli olabilir .
Ramos – yapısal SHM uğrar Burkitt lenfoma hücre hattı – SHM 18-24 incelemek için popüler bir hücre-line model olmuştur. Ramos hücrelerinin bir avantajı yerleşik rahat yarı olmasıSHM, nicel bir ölçüsüdür. Vahşi tip hücreleri mutasyonlar, bazı mutasyonların IgM ifade knock out pick up, IgM ifade ve. Bu nedenle, floresan ile aktive olan hücre tarama (FACS) IgM kaybı assaying SHM düzeyi için hızlı okuma sağlar. SHM daha nicel ölçümü doğrudan antikor genleri sıralama elde edilebilir.
Ramos hücreleri transfect zor olduğundan, biz istikrarlı ve türevleri üretmek, sırasıyla aşırı ekspresyonu kaset ya da kısa bir saç tokası RNA (shRNA), ya içeren retroviral veya lentiviral yapıları hücrelerini enfekte artış ya da bireysel bir gen ifade düşürdü. Burada, biz Ramos hücreleri enfekte ve sonra SHM (Şekil 1) belirli genlerin rolünü araştırmak için bu hücrelerin nasıl kullandıklarını açıklar.
Protocol
Discussion
Daha önce tartışıldığı üzere, antikor çeşitlendirilmesi için hücre hattı modelleri, antikor çeşitlendirilmesi sırasında farklı adımlar etkiler roman proteinleri tespit etmek için popüler bir başlangıç noktası haline gelmiştir. Biz burada, Ramos, B-hücre hattı viral enfeksiyon ya knock-aşağı veya eksprese proteinlerine kullanmak için bir yöntem mevcut ve sonra SHM üzerindeki etkisini incelemek.
Bu çalışmalar için, biz WT Ramos ve YARDIM hi</sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PMSCV YARDIM-I-Thy1.1 ve pKat2 vektörler DG Schatz ve pVSV-G, pRSV-Rev bir tür hediye ve pMDLg / pRRE vektörler BR Cullen bir tür hediye edildi.
Materials
Suggested reagents – most of these may be substituted with similar products from other vendors.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| 6-well clear TC-treated plates | Corning | 3516 | |
| 10 mL BD Luer-Loksyringes | BD Medical | 309604 | |
| 24-well clear TC-treated plates | Corning | 3526 | |
| 96-well clear flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3596 | |
| 100 mm TC-treated culture dishes | Corning | 430167 | |
| Acrodisc syringe filters, 0.45 μm | Pall Life Sciences | 4604 | |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100 mg/mL in water |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | or similar | |
| BD Falcon round bottom polystyrene tubes | BD Biosciences | 352054 | for FACS |
| BOSC 23 cells | ATCC | CRL-11270 | |
| CO2 incubator capable of 37°C | |||
| DMEM (Dulbecco′s modified Eagle′s medium) | Sigma | D6429 | |
| FBS (fetal bovine serum) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FITC α-rat CD90/mouse CD90.1 antibody | BioLegend | 202503 | FITC α-Thy1.1 |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11814443001 | |
| HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 | |
| KAPA HiFi DNA polymerase | KAPA Biosystems | KK2101 | |
| LB Broth (lysogeny broth – Luria) Powder | Difco | 240230 | |
| MISSION TRC shRNA bacterial glycerol stock | Sigma | shRNA vectors | |
| NCS (newborn calf serum) | Gemini Bio-Products | 100-504 | |
| PBS (phosphate buffered solution) | Invitrogen | 70011 | diluted to 1x in water |
| PE α-human IgM antibody | BioLegend | 314508 | |
| PGS (penicillin-streptomycin-glutamine solution) | Gemini Bio-Products | 400-110 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | 107689 | 10 mg/mL in water |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2495 | |
| Puromycin | Sigma | P8833 | 250 μg/mL in water |
| QIAquick gel extraction kit | QIAGEN | 28706 | |
| Ramos (RA 1) cells | ATCC | CRL-1596 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| SuperScript II | Invitrogen | 18064-022 | |
| SYBR FAST qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4601 | |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 18038-042 | |
| TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | K4520-01 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596-026 | |
| Wizard SV Genomic DNA purification system | Promega | A2361 | |
| X-Gal [5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galatopyranoside] | Growcells | C-5687 | 40 mg/mL in DMSO |
References
- Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation. Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).
- Peled, J. U. The biochemistry of somatic hypermutation. Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).
- Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. AID in somatic hypermutation and class switch recombination. Curr. Opin. Immunol. 18, 164-174 (2006).
- Bardwell, P. D. Altered somatic hypermutation and reduced class-switch recombination in exonuclease 1-mutant mice. Nat. Immunol. 5, 224-229 (2004).
- Martomo, S. A., Yang, W. W., Gearhart, P. J. A role for Msh6 but not Msh3 in somatic hypermutation and class switch recombination. J. Exp. Med. 200, 61-68 (2004).
- Phung, Q. H. Increased hypermutation at G and C nucleotides in immunoglobulin variable genes from mice deficient in the MSH2 mismatch repair protein. J. Exp. Med. 187, 1745-1751 (1998).
- Rada, C., Ehrenstein, M. R., Neuberger, M. S., Milstein, C. Hot spot focusing of somatic hypermutation in MSH2-deficient mice suggests two stages of mutational targeting. Immunity. 9, 135-141 (1998).
- Rada, C. Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice. Curr. Biol. 12, 1748-1755 (2002).
- Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. DNA polymerase eta is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse. J. Exp. Med. 204, 17-23 (2007).
- Masuda, K. DNA polymerase eta is a limiting factor for A:T mutations in Ig genes and contributes to antibody affinity maturation. Eur. J. Immunol. 38, 2796-2805 (2008).
- Lim, D. S., Hasty, P. A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53. Mol. Cell. Biol. 16, 7133-7143 (1996).
- Xiao, Y., Weaver, D. T. Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mre11 protein in murine embryonic stem cells. Nucleic. Acids. Res. 25, 2985-2991 (1997).
- Zhu, J., Petersen, S., Tessarollo, L., Nussenzweig, A. Targeted disruption of the Nijmegen breakage syndrome gene NBS1 leads to early embryonic lethality in mice. Curr. Biol. 11, 105-109 (2001).
- Luo, G. Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryonic development, and sensitivity to ionizing radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7376-7381 (1999).
- Pavri, R. Activation-induced cytidine deaminase targets DNA at sites of RNA polymerase II stalling by interaction with Spt5. Cell. 143, 122-133 (2010).
- Lee-Theilen, M., Matthews, A. J., Kelly, D., Zheng, S., Chaudhuri, J. CtIP promotes microhomology-mediated alternative end joining during class-switch recombination. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 75-79 (2011).
- Basu, U. The RNA exosome targets the AID cytidine deaminase to both strands of transcribed duplex DNA substrates. Cell. 144, 353-363 (2011).
- Yabuki, M., Fujii, M. M., Maizels, N. The MRE11-RAD50-NBS1 complex accelerates somatic hypermutation and gene conversion of immunoglobulin variable regions. Nat. Immunol. 6, 730-736 (2005).
- Sale, J. E., Neuberger, M. S. TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line. Immunity. 9, 859-869 (1998).
- Cumbers, S. J. Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines. Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).
- Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes. Nature. 408, 216-221 (2000).
- Parsa, J. Y. AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position. Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).
- Zhang, W. Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt’s lymphoma cell line. Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).
- Ukai, A. Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location. J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).
- Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).
- Nakamura, M. High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells. Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).
- Muramatsu, M. Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells. J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).
