VisioTracker, uma abordagem inovadora Automatizada de Análise Oculomotor
Summary
O VisioTracker é um sistema automatizado para a análise quantitativa do desempenho visual de peixes adultos e larvas pequeno baseado no registro dos movimentos oculares. Ele possui total controle sobre propriedades de estímulo visual e análise em tempo real, permitindo alto rendimento de pesquisa em campos como o desenvolvimento do sistema visual e função, farmacologia, estudos de circuitos neurais e integração sensório-motora.
Abstract
As investigações sobre o desenvolvimento do sistema visual e função exigir quantificáveis modelos comportamentais de desempenho visual que são fáceis de obter, robusto e simples de manipular. Um modelo adequado foi encontrado na resposta optocinético (OKR), um comportamento reflexivo presente em todos os vertebrados, devido ao seu valor elevado de selecção. O OKR envolve lentos estímulo seguintes os movimentos dos olhos alternados com rápidos sacadas reajuste. A medição deste comportamento é facilmente realizado em larvas de peixe-zebra, devido ao seu início precoce e estável (plenamente desenvolvida após 96 horas pós-fertilização (hpf)), e beneficiando de o conhecimento completo sobre zebrafish genética, por décadas um do modelo preferido organismos nesta área. Enquanto isso, a análise de mecanismos similares em peixes adultos ganhou importância, principalmente para aplicações farmacológicas e toxicológicas.
Aqui descrevemos VisioTracker, totalmente automatizada e de alta throughput sistema para análise quantitativa do desempenho visual. O sistema é baseado em pesquisas realizadas no grupo do Prof Stephan Neuhauß e foi re-desenhado por Sistemas TSE. Ele consiste de um dispositivo de imobilização para os peixes pequenos monitorado por uma câmera de vídeo de alta qualidade equipada com uma lente zoom de alta resolução. O recipiente de peixe está rodeado por uma grade do tambor rotativo, em que os padrões gerados por computador de incentivos pode ser projectada. Os movimentos dos olhos são registadas e analisadas automaticamente pelo pacote de software VisioTracker em tempo real.
A análise dos dados permite o reconhecimento imediato de parâmetros tais como duração da fase de lenta e rápida, frequência do ciclo de movimento lento, em fase de ganho, acuidade visual e sensibilidade ao contraste.
Os resultados típicos permitir, por exemplo, a rápida identificação de mutantes do sistema visual que mostram nenhuma alteração aparente na morfologia do tipo selvagem, ou na determinação dos efeitos quantitativos do farmacológicos ou tóxicos e mutagénicosagentes no desempenho do sistema visual.
Protocol
Discussion
A importância da OKR para o estudo da função visual foi reconhecido na comunidade científica por um longo tempo (Páscoa e Nicola 1996, 1997), e as tentativas de realmente quantificar o paradigma começaram bem mais de uma década atrás. Páscoa e Nicola (1996) desenvolveu um sistema motorizado com tambores rotativos listradas, onde a gravação de vídeo de movimento dos olhos foi analisada manualmente. Este sistema sofreu da falta de imobilização do embrião de peixe, que é exigido manual do reposicionamento frequente, e podem detectar os movimentos de rastreamento de olhos apenas com grande dificuldade. Um passo foi a utilização de um tambor de vídeo-listrado projectada para permitir a apresentação do estímulo mais variáveis geradas por computador (Roeser & Baier, 2003;. Rinner et al, 2005a).
A maior parte manual, análise do quadro-a-quadro de gravação em vídeo tem provado ser extremamente laborioso, e até um certo grau dificultada pelo observador viés (Beck et al.,2004). Análise automatizada em tempo real foi sugerido para permitir a utilização de mecanismos de feedback comportamentais de aprendizagem (Major et al., 2004). O uso de iluminação infravermelha e frequência controlada estímulos rotativas foi iniciada por Beck et al. (2004). No entanto, o sistema descrito não só tem sido utilizado para as larvas, e a análise foi realizada off-line. Além disso, o VisioTracker permite o controlo completo sobre a estímulos, incluindo alterar o estímulo durante a experiência, permitindo assim uma maior flexibilidade e espontânea influência sobre o curso da experiência. Além disso, a criação de estímulo digital utilizado pelo VisioTracker superaram os problemas mencionados anteriormente com a aceleração da massa inerte de um tambor de estímulo listrado (Beck et al., 2004).
Restrição larvas por metilcelulose não interfere significativamente com o movimento dos olhos e não tem quaisquer efeitos de longo prazo sobre zebrafish bem-estar. Larvas de peixes foram sucessomantida incorporado em metilcelulose durante vários dias, até que o fornecimento de oxigénio através da pele torna-se insuficiente para a procura com o aumento da idade (Qian et al., 2005).
O adulto método de restrição de peixe é igualmente fácil sobre o animal. A curta duração da experiência, em conjunto com a opção de trocar rapidamente o animal de teste para uma diferente, aumenta ainda mais os aspectos positivos do bem-estar dos animais do sistema. Uma vez que as brânquias são continuamente lavado com água, é conveniente a espiga da água com os produtos químicos de escolha para estudar o seu efeito sobre os movimentos dos olhos e do desempenho visual. Da mesma forma um experimento de wash-out podem ser adicionados sem a necessidade de manusear o animal entre as experiências.
Ruído pixel da imagem de vídeo foi minimizado pelo alisamento algoritmos do software VisioTracker proprietário, permitindo medições altamente precisas da posição do olho e velocidade angular. Além disso, para facilitar a estatísticaanálise, o software filtrados movimentos sacádicos que ocorrem em velocidade fixa e não contribuem para a afirmação experimental. Uma média de curvas de velocidade mais de 7 quadros de vídeo facilitou a análise posterior.
O VisioTracker abre uma nova dimensão para muitas áreas de pesquisa variadas. O sistema e os seus antecessores já foram utilizados com sucesso para quantificar o desempenho visual em larvas do peixe, usando parâmetros como acuidade visual, sensibilidade ao contraste e adaptação à luz (Rinner et al., 2005a, Schonthaler et al., 2010), de análise funcional do fotorreceptores cone após a manipulação dos membros da cascata de transdução visual (por exemplo, Rinner et al, 2005b, Renninger et al, 2011..), ou a análise dos defeitos visuais em larvas do peixe mutante (por exemplo, Schonthaler et al, 2005, 2008,. Bahadori et al., 2006). A interdependência de maturação morfológica e funcional do sistema visualfoi estudado através de medições okr para mostrar que a acuidade visual é principalmente, mas não completamente limitada por espaçamento de fotorreceptores em estágios larvais (Haug et al., 2010).
O VisioTracker é igualmente adequado para analisar a função visual em zebrafish adultos e outras semelhantes espécies de peixes de tamanho (Mueller e Neuhauß (2010), este relatório).
Também é concebível utilizar o sistema em áreas de pesquisa, tais como a farmacologia toxicologia ou em que as substâncias a serem investigadas podem ser adicionados ao fluxo de água em torno das guelras dos peixes adultos. Além disso, a versatilidade do VisioTracker permite análises mais completas, por exemplo, de ontogenéticas da função visual, a função do circuito neural e desenvolvimento, ou controle sensório-motor (ver revisão em Huang & Neuhauß, 2008).
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
KPM foi apoiado pela UE FP7 (RETICIRC).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0387 |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 |
| 35 mm cell culture dish | Corning | 430165 |
| Serum pipette | Greiner bio-one | 612 361 |
| VisioTracker | TSE Systems | 302060 |
References
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