Cortical नेटवर्क के विकास में कार्यात्मक कैल्शियम इमेजिंग
Summary
Neuronal नेटवर्क के विकास के स्वतःस्फूर्त गतिविधि हूँ कैल्शियम के प्रति संवेदनशील सूचक रंगों के एस्टर रूपों का उपयोग करके मापा जा सकता है है. Intracellular कैल्शियम में परिवर्तन, neuronal सक्रियण संकेत, सूचक प्रतिदीप्ति में क्षणिक परिवर्तन के रूप में एक या दो photon इमेजिंग के साथ पाया जाता है. इस प्रोटोकॉल developmentally पर निर्भर neuronal नेटवर्क की एक श्रृंखला के लिए अनुकूलित किया जा सकता है है<em> इन विट्रो में</em>.
Abstract
A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz & Shatz, 1996; Khaziphov & Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic & Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.
Protocol
1. क्षैतिज entorhinal hippocampal मस्तिष्क स्लाइस बनाना Entorhinal-hippocampal मस्तिष्क स्लाइसें संरचनात्मक गाइड, सर्ग Wouterlood, और (2008) तंत्रिका plasticity आईडी 381,243 नौ Witter के अनुसार क्षेत्र के एक 3D सिंहावलोकन में विस्तृत उपयोग किया जाता है. कम से कम 20 मिनट के लिए टुकड़ा समाधान 500ml, carbogen गैस (95% ऑक्सीजन, 5% कार्बन डाइऑक्साइड) के साथ आक्सीजन के साथ मिलना और फिर ठंडी जब तक 250ml फ्रीज. टुकड़ा करने की क्रिया से पहले मिनट कुचलने, और शेष 250ml बुदबुदाती टुकड़ा विच्छेदन के लिए और टुकड़ा करने की क्रिया कक्ष में काटने के लिए इस्तेमाल किया जा समाधान के साथ बर्फ टुकड़ा मिश्रण. R-ACSF की 200ml (वसूली ACSF) और कम से कम (प्रायोगिक ACSF) ई – ACSF समाधान के 500ml बनाओ. ऊतक तैयार होने से पहले कम से कम 20 मिनट के लिए लगातार आक्सीजन के साथ मिलना carbogen गैस (95% ऑक्सीजन, 5% कार्बन डाइऑक्साइड) के साथ दोनों समाधान. इस प्रोटोकॉल एक के 3 सप्ताह पुरानी अधिकतम करने के लिए चुप 0 प्रसवोत्तर दिन से चूहों के लिए मान्य है. एनिमा सिर काटनाएल, स्थानीय नैतिक समिति प्रक्रियाओं के अनुसार, और बाहर मस्तिष्क जल्दी ठंडा चरण 1 में तैयार टुकड़ा, ऊपर समाधान युक्त एक पेट्री डिश में टुकड़े करना (समाधान और अभिकर्मकों के लिए तालिका 1 देखें). मस्तिष्क टुकड़ा समाधान के साथ एक फिल्टर लथपथ कागज पर स्थानांतरण और एक तेज धार के साथ दो गोलार्द्धों अलग. ठंडा टुकड़ा समाधान में एक गोलार्द्ध वापस स्थानांतरण. अन्य गोलार्द्ध के सेरिबैलम निकालें. अपने midline पर मस्तिष्क पलटें और विजय – स्तम्भ अंत की दिशा में एक मामूली कोण के साथ मस्तिष्क के ऊपर कटौती. (पृष्ठीय) में कटौती सतह उल्टा slicer के ऊतक धारक पर और यह गोंद पर धीरे एक कपास कली के साथ धक्का द्वारा मस्तिष्क फ्लिप. स्लाइस 300 सुक्ष्ममापी मोटी मस्तिष्क शेष बर्फ ठंड टुकड़ा चरण 1 में बनाया समाधान में एक कम आवृत्ति और गति का उपयोग स्लाइस. हमारे शर्तों के तहत, हम 0.05 मिमी / और 36Hz सेटिंग्स पर थर्मो फिशर साइंटिफिक vibratome (Microm, 650V एचएम) का उपयोग करें. के रूप मेंकमरे के तापमान पर. जल्द ही के रूप में एक टुकड़ा काट रहा है, यह एक टुकड़ा धारक oxygenated कृत्रिम Cerebro रीढ़ की हड्डी (ACSF) द्रव (तालिका 2 देखें 2.5mm 2 मिलीग्राम +, 1.6mm 2 Ca +) युक्त (जलमग्न) में स्थानान्तरण एक उच्च r-ACSF में मैग्नीशियम एकाग्रता टुकड़ा करने की क्रिया और हमारे अनुभव में निम्नलिखित NMDA रिसेप्टर्स के माध्यम से न्यूरॉन्स में कैल्शियम की आमद कम कर देता है, प्रयोगों के लिए एक स्लाइस की बेहतर गुणवत्ता के लिए होता है. यदि आवश्यक हो, दूसरा मस्तिष्क गोलार्द्ध बाद में काटा. पुनर्प्राप्त करने के लिए एक घंटे के लिए छोड़ दो स्लाइस. स्लाइस (मिमी में) समाधान – 10 110 choline क्लोराइड 25 3 NaHCO 11.6 11.6 10 डी शर्करा 7 2 MgCl 3.1 sodiumpyruvate 2.5 KCl 1.25 नाह 4 पीओ 2 0.5 2 CaCl तालिका 1 टुकड़ा समाधान के लिए नुस्खा. ACSF (मिमी में) 125 NaCl 26 3 NaHCO 10 डी शर्करा 3 KCl 2.5/1.5 MgCl 2 (वसूली प्रयोग /) 1.6 2 CaCl 1.25 नाह 4 पीओ 2 टेबल 2 दोनों (नि. ACSF) वसूली और प्रयोगात्मक (ई – ACSF) समाधान के लिए नुस्खा . 2. धुंधला हो जाना चर्चा की तैयारीएम्बर कैल्शियम पर निर्भर सूचक या सेल विशिष्ट मार्कर के साथ कोशिकाओं लोड करने के लिए, स्लाइस धुंधला प्रक्रिया के लिए एक कक्ष में स्थानांतरित करने की आवश्यकता है. हालांकि वाणिज्यिक कक्षों उपलब्ध हो सकता है, एक बहुत कम लागत के लिए आसानी से मानक प्रयोगशाला उपकरणों से कर सकते हैं इकट्ठे हो. इस तरह के एक कक्ष के प्रमुख विशेषताएं हैं कि स्लाइस के लिए 30 और 35 के बीच गर्म कर रहे हैं डिग्री सेल्सियस, एक लगातार oxygenated मध्यम और चैम्बर प्रकाश से परिरक्षित है कि incubated. एक गर्म रॉड का उपयोग करना, दो डिस्पोजेबल polystyrene पेट्री डिश की ओर दीवार (35 और 100mm व्यास) में एक छोटा सा छेद है कि बस काफी बड़ा सिलिकॉन टयूबिंग की एक खंड (1.5mm व्यास लगभग) की अनुमति के माध्यम से पारित है. थ्रेड छोटे पेट्री डिश में छेद के माध्यम से सिलिकॉन टयूबिंग और छोटे पकवान की भीतरी दीवार के अंदर एक पाश फार्म. Superglue के लिए टयूबिंग के खुले अंत सील और पेट्री डिश के भीतरी दीवार टयूबिंग के बाकी छड़ी का प्रयोग करें. </li> एक सुई का प्रयोग, भीतर पेट्री डिश के भीतर टयूबिंग में समान रूप से स्थान के अंतराल पर ठीक छेद बनाते हैं. गोंद एक बड़ा अंदर छोटे पेट्री दोनों छेद के साथ गठबंधन, पकवान. बड़े पेट्री डिश की दीवार में छेद के माध्यम से सिलिकॉन टयूबिंग के दूसरे छोर थ्रेड. इंटरफ़ेस पकवान के लिए एक सेल संस्कृति अर्द्ध पारगम्य झिल्ली के साथ अच्छी तरह से सम्मिलित और एक गरम स्केलपेल का उपयोग कर, शीर्ष 1cm दूर करने के लिए एक उथले डिश छोड़ ऊष्मायन के दौरान स्लाइस पकड़ में कटौती. बड़े पेट्री डिश के ढक्कन पर, एक छेद लगभग बनाते हैं. 0.5-1cm carbogen (95% 2 हे, 5% सीओ 2) के लिए अनुमति देने के कक्ष में प्रवाह व्यास. 5 एक या 10ml प्लास्टिक सिरिंज ले लो. एक गर्म स्केलपेल का उपयोग, एक angled कटौती करने के लिए सिरिंज के अंत हटाने और टिप के साथ सिरिंज ट्यूब के कुछ सेमी लंबाई रखने के लिए. Superglue का प्रयोग, पेट्री डिश ढक्कन सिरिंज ट्यूब की कटौती की सतह, 0.5 1cm व्यास छेद पर देते हैं. सिलिकॉन टयूबिंग और संलग्नसिरिंज टिप करने के लिए संबंधक ubing. सिलिकॉन टयूबिंग पेट्री डिश के आधार में प्रवेश के लिए एक और टयूबिंग संबंधक संलग्न. (95% 2 हे, 5% सीओ 2) carbogen आपूर्ति के लिए एक नियामक दोनों ट्यूबों कनेक्ट. एक गर्म थाली पर ऊष्मायन के लिए धुंधला 30-35 के बीच चैम्बर ° सी. प्लेस सुनिश्चित करें कि कक्ष पूरे ऊष्मायन प्रक्रिया के दौरान प्रकाश से परिरक्षित किया जा सकता है. अब धुंधला कक्ष को इकट्ठा और टुकड़ा ऊष्मायन के लिए उपयोग करने के लिए तैयार है. पद्धति चित्रा 1 टुकड़ा ऊष्मायन (ऊपर) और कैल्शियम संवेदनशील संकेतक (हरी डाई, नीचे pipetted) के आवेदन दिखा धुंधला चैम्बर के क्रॉस अनुभाग. 3. स्लाइस की धुंधला किसी भी फ्लोरोसेंट रंजक शामिल से निपटने के दौरान, थोड़ा प्रकाश के साथ काम करके photobleaching से बचने और डाई और टी रखनेवह हैंडलिंग के बीच अंधेरे में ऊतक दाग. एक गर्मी प्लेट (35 डिग्री सेल्सियस) पर धुंधला चैम्बर रखो, यह एक carbogen गैस की आपूर्ति से कनेक्ट करने और लगभग 1.5ml r-ACSF के साथ यह टुकड़ा धारक से भरने. धुंधला कक्ष में इंटरफ़ेस पकवान प्लेस और यह 1ml ACSF के साथ भरने. धुंधला कक्ष में एक अच्छा carbogen आपूर्ति सुनिश्चित करने के लिए एक सौम्य, स्थिर दर पर ACSF बुदबुदाती रखने के लिए. 50 μg 2 AM Fura की एक शीशी में 9 μl DMSO और 1 μl pluronic एसिड (DMSO के शेयर समाधान में 20%, Invitrogen) जोड़ें. 15 मिनट के लिए डाई मिश्रण भंवर. इंटरफ़ेस डिश में स्लाइस स्थानांतरण और आर – ACSF में hippocampal और entorhinal ब्याज की प्रांतस्था क्षेत्र, के रूप में पद्धति चित्रा 1 (ऊपर) में संकेत पर सीधे डाई, पिपेट 50mm की एक अंतिम डाई एकाग्रता को प्राप्त करने. धुंधला चैम्बर के ढक्कन बंद करें और 20 के लिए सेते डाई – 40 मिनट जानवर की उम्र पर निर्भर करता है (3 टेबल देखें). ट्रांसटुकड़ा धारक में वापस स्लाइस fer. आयु (प्रसव के बाद दिन) ऊष्मायन समय (मिनट) <p8 20 p8 – p9 25 p10-p11 30 p12-13 35 p13> 40 तालिका 3 अलग अलग उम्र के लिए ऊष्मायन बार प्रयोगशाला में empirically निर्धारित है. 4. अन्य रंजक और बड़े ऊतक शायद कारण मस्तिष्क के ऊतकों में वृद्धि myelination पुराने कृन्तकों से स्लाइस Fura नहीं लेते एस्टर है कि आसानी से 2 AM. इस डाई चूहों के दिमाग के लिए एक preincubation कदम का उपयोग Cremophor ईएल (सिग्मा) p13 और 11 बड़े में प्रयोग किया जाता है तेज की सुविधा. Cremophor एक गैर ईओण surfactant कई Pharmaceutic में एक excipient के रूप में इस्तेमाल किया हैअल अनुप्रयोगों. इस कदम के बिना, हम पाते हैं कि सेल विशिष्ट लेबलिंग अत्यंत गरीब और cortical टुकड़ा भर असंगत है. एक उथले preincubation r-ACSF 3ml और 8 μl 0.5% (सिग्मा) cremophor 35 से गरम डिग्री सेल्सियस 3 मिनट के लिए से भरा पकवान में पुराने स्लाइस स्थानांतरण. इंटरफ़ेस डिश में स्लाइस स्थानांतरण और सामान्य धुंधला प्रक्रिया (4-7 कदम, ऊपर देखें) का पालन करें. कैल्शियम रंजक टुकड़ा तैयारी में दोनों न्यूरॉन्स और गैर – न्यूरॉन्स लोड. पहचान और नेटवर्क के भीतर इन प्रकार की कोशिकाओं के बीच भेद करने के लिए, sulforhodamine 101 (SR101) टुकड़ा के भीतर लेबल astrocytes के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 101 sulforhodamine के लिए स्लाइस की धुंधला पहले (धारा 3) के रूप में 1-3 चरणों का पालन करें. -20 डिग्री सेल्सियस पर इसके भंडारण से sulforhodamine (सिग्मा) के 10mm शेयर समाधान के 1 μl ले लो और 999 μl r-ACSF में भंग करने के लिए एक 10 सुक्ष्ममापी समाधान दे. बैंगनी डाई ov पिपेटएर पहले के रूप में स्लाइस (चरण 5-7), 15 मिनट की अवधि के लिए incubating स्लाइस को छोड़कर. Microglia और endothelial कोशिकाओं FITC टमाटर लेक्टिन डाई का उपयोग करने के लिए चिह्नित कर रहे हैं पहले के रूप में 1-3 चरणों का पालन करें. 2mg/ml Lycopersicon (टमाटर) esculentum लेक्टिन FITC (L0401, सिग्मा) r-ACSF 2.5ml में संयुग्म स्टॉक समाधान के लिए 20 एकाग्रता / μg मिलीलीटर देने के 25 μl लो. पहले (चरण 5-7) के रूप में स्लाइस पर डाई पिपेट, 45 मिनट की अवधि के लिए incubating स्लाइस को छोड़कर. नोट: यह संभव 2 AM Fura या ओरेगन ग्रीन BAPTA-1 (OGB-1) है कि स्पेक्ट्रम के दोनों रंगों से फोटॉनों से हरे रंग की रेंज में प्रतिदीप्ति उत्सर्जित हो जाएगा तरह एक कैल्शियम के प्रति संवेदनशील सूचक के साथ इस डाई गठबंधन नहीं है अतिव्यापी तरंगदैर्य पर. हालांकि, वहाँ कैल्शियम नारंगी, Fura लाल जैसे अन्य कैल्शियम सूचक रंजक है कि उपयुक्त फिल्टर या टेक्सास रेड लेक्टिन conjugates के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है बुद्धि गठबंधन कर रहे हैंज हरी स्पेक्ट्रम में कैल्शियम सूचक रंजक. 5. रिकॉर्डिंग कक्ष में स्लाइसें संलग्न दौरान इमेजिंग स्लाइस खुर्दबीन के नीचे स्थिर होने की जरूरत है. आम तौर पर एक धातु वीणा नीचे ऊतक पकड़ रखा है, लेकिन यह असमान टुकड़ा की सतह विकृत कर सकते हैं इमेजिंग के लिए ध्यान में देखने के क्षेत्र का ही हिस्सा दे. इस से बचने के लिए, स्लाइस रिकॉर्डिंग कक्ष Polyethylenimine (पी) का उपयोग करने के लिए फंस रहे हैं. पी (250ml बोरिक बफर (तालिका 4) में 1ml Polyethyleneimine समाधान) समाधान तैयार है. सुनिश्चित करें कि पी पूरी तरह घुल (रातोंरात हलचल). पी समाधान के साथ रिकॉर्डिंग कक्षों भरें ताकि नीचे कम से कम एक घंटे के तरल पदार्थ के साथ कवर किया जाता है इससे पहले कि आप स्लाइस को लागू करना चाहते हैं हैं आसुत जल के साथ और फिर होल्डिंग कक्ष से आर ACSF साथ रिकॉर्डिंग कक्षों धो लें. एक रिकॉर्डिंग कक्ष में एक टुकड़ा स्थानांतरण. एक विंदुक और स्थिति sl के साथ आर ACSF निकालेंएक ब्रश का उपयोग कर बीच में बर्फ. Filterpaper के टुकड़े का उपयोग टुकड़ा के चारों ओर r-ACSF निकालें. स्थिरता और पालन के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि वहाँ अब टुकड़ा आसपास कोई ACSF है. पिपेट लगभग 0.5 ACSF 1ml, टुकड़ा पर रिकार्डिंग कक्ष के आकार पर निर्भर करता है. ACSF सिर्फ टुकड़ा सतह को कवर किया जाना चाहिए. टुकड़ा के साथ एक बड़े humidified इंटरफ़ेस कंटेनर, carbogen के साथ perfused रिकॉर्डिंग कक्ष में रखो और दो स्लाइस कम से कम एक घंटे के लिए ठीक है. पी समाधान 1ml पाली समाधान (ethyleneimine) 250ml बोरिक बफर में 40mm बोरिक अम्ल 10mm सोडियम tetraborate decahydrate टेबल नुस्खा 4. पी समाधान. 6. Imउम्र बढ़ने कैल्शियम पर निर्भर सूचक रंजक या तो एक या दो photon माइक्रोस्कोपी उपयोग imaged किया जा सकता है. केवल दो photon इमेजिंग के प्रयोग के हित के क्षेत्र के केन्द्र की मात्रा के भीतर सूचक डाई सक्रिय है, इस प्रकार ऊतक में प्रकाश तितर बितर की मात्रा को कम करने. इसके अलावा, यह बेहतर टुकड़ा में प्रकाश की गहराई पैठ में सक्षम बनाता है. कार्यात्मक कैल्शियम इमेजिंग के लिए हम एक टाइटेनियम नीलमणि एक 20x (0.95 एनए) उद्देश्य और LaVision बायोटेक द्वारा एक Trimscope प्रणाली के साथ एक ओलिंप खुर्दबीन सुसंगत युग्मित द्वारा आपूर्ति लेजर का उपयोग करें. Trimscope प्रणाली एक साथ 64 beamlets साथ फ्रेम स्कैनिंग के लिए सक्षम बनाता है और तेजी से फ्रेम स्कैनिंग दरों के लिए हमामात्सू C9100-EM सीसीडी कैमरा के साथ मिलकर. माइक्रोस्कोप के तहत रिकॉर्डिंग कक्ष स्थिति और ई – ACSF इमेजिंग (1.6 2 Ca मिलीग्राम + / 1.5 2 + अनुपात (तालिका 2)) के साथ एक स्थिर छिड़काव कम से कम 30 की एक और अधिक शारीरिक तापमान डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म स्थापित एफ ओ सीहमें ब्याज (आरओआई) सफेद रोशनी रोशनी का उपयोग करने के क्षेत्र में. अब से अधिक आवश्यक प्रकाश टुकड़ा को उजागर करने से बचें. तरंग दैर्ध्य देखने के इमेजिंग के क्षेत्र, स्कैनिंग आवृत्ति, पिक्सेल घनत्व और अतिरिक्त सॉफ्टवेयर ऊतक और जैविक संकेतों आप को मापने चाहते हैं के लिए लागू विकल्प चुनें. कैल्शियम Fura के साथ नेटवर्क इमेजिंग के लिए 2-AM हम आम तौर पर 820nm, देखने का एक 250×250 सुक्ष्ममापी इमेजिंग क्षेत्र की एक तरंग दैर्ध्य, 1200Hz के linescanning आवृत्ति और 2 द्वारा-2 binning चुनें. के बारे में 100ms और इस प्रकार 10Hz के बारे में एक इमेजिंग आवृत्ति की एक frametime में यह परिणाम है. जाँच करें अगर आपके ROI को ध्यान में है एक सतत स्कैनिंग मोड और laserlight के चयनित तरंग दैर्ध्य का उपयोग. पिक्सेल और अपनी छवि के संतृप्ति विरंजन से बचने के लिए ध्यान केंद्रित करने और लेजर की तीव्रता को समायोजित करने के लिए. आपके ROI के एक timelapse फिल्म बनाओ. आम तौर पर हम 2000 प्रत्येक फ्रेम के दो timelapse फिल्में हासिल. सेल का पता लगाने और पहचान के लिए, Z-ढेर ले एक सुक्ष्ममापी की एक stepsize का उपयोग और imag ई + / 20 आपका ध्यान के imaged विमान के आसपास सुक्ष्ममापी. 7. प्रतिनिधि परिणाम कैल्शियम संकेतकों के सफल लोड हो रहा है, Fura दो AM चित्रा 1 में neocortical और entorhinal प्रांतस्था multiphoton इमेजिंग का उपयोग कर नेटवर्क के विकास में दिखाया जाता है. कुछ डाई अभी भी ऊतक लेकिन सेल सोम और कुछ मामलों में पृष्ठभूमि धुंधला के रूप में मौजूद है, प्रॉक्सिमल dendrites स्पष्ट रूप से दिखाई और neuropil आसपास से अलग हैं. यदि लोड हो रहा सफल नहीं किया गया है, बहुत कम सेल विशिष्ट धुंधला मनाया है और डाई स्पॉट के छोटे समूहों अक्सर मृत झिल्ली मलबे में टुकड़ा सतह पर दिखाई दे रहे हैं. इन स्क्रीनशॉट में, कोशिकाओं के नेटवर्क के युगपत सेल इमेजिंग के लिए ध्यान केंद्रित करने का एक ही विमान में स्पष्ट रूप से दिखाई देता है. एक धातु वीणा या रिकॉर्डिंग कक्ष टुकड़ा अधूरा चिपके का प्रयोग एक असमान सतह टुकड़ा में परिणाम imaged किया जा सकता है. 550fig1.jpg "Alt =" 1 / चित्रा "> चित्रा 1. AM Fura-2 एस्टर लोड neocortical विकासशील (एक छोड़ दिया,) और entorhinal नेटवर्क (बी, सही) स्केल सलाखों 100 सुक्ष्ममापी. Astrocytes से न्यूरॉन्स को अलग करने के लिए, सह Fura साथ sulforhodamine 101 के आवेदन 2-AM एस्टर नेटवर्क के भीतर सेल प्रकार की जुदाई में सक्षम बनाता है. चित्रा 2. 101 sulforhodamine साथ astrocyte लेबलिंग. 2 AM Fura एस्टर और sulforhodamine 101 के सह – लेबलिंग. उत्तेजना तरंगदैर्ध्य: 820nm. (ऊपर) न्यूरॉन और एक astrocyte (नीचे) से तरंगदैर्ध्य जुदाई के लिए 560/70nm dichroic दर्पण के साथ PMTs पर छवि संग्रह बी प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति निशान. स्केल सलाखों के 60 सेकंड, 10 ΔF (ऑ fluo). चित्रा 3. FITC संयुग्मित Lycopersicon esculentum (टमाटर) धुंधला लेक्टिन माउस (ए) हिप्पोकैम्पस और सतही entorhinal प्रांतस्था (बी) के विकास में microglia और endothelial कोशिकाओं की लेबलिंग . कैल्शियम सूचक रंगों cortical और hippocampal नेटवर्क के विकास में एकाधिक कोशिकाओं से गतिविधि पढ़ने के बाहर एक साथ उपयोग किया जाता है. चित्रा 4. Hippocampal और cortical नेटवर्क में गतिशील कैल्शियम यात्रियों. 1 मूवी: Fura 2 AM माउस entorhinal प्रांतस्था के प्रसव के बाद दूसरे सप्ताह के दौरान एस्टर लोड हो रहा है. 1 मूवी देखने के लिए यहाँ क्लिक करें . 2 मूवी: Fura 2 AM पहले प्रसव के बाद सप्ताह के दौरान माउस हिप्पोकैम्पस के एस्टर लोड हो रहा है. 2 फिल्म देखने के लिए यहाँ क्लिक करें . मूवी 3: माउस प्रांतस्था के Fluo 4 पहले प्रसव के बाद सप्ताह के दौरान लोड हो रहा है. 50movie3.avi "> 3 फिल्म देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. Fura के मामले में 2 AM एस्टर, सेल सक्रियण, कैल्शियम की एक बाढ़ विध्रुवण प्रेरित शामिल डाई प्रतिदीप्ति घट जाती है. Fluo-4 जैसे रंगों के लिए, विपरीत सच है और सेल विध्रुवण फोटॉन उत्सर्जन में वृद्धि के रूप में मनाया जाता है. दैहिक कैल्शियम यात्रियों को मुख्य रूप से मापा जाता है, लेकिन बड़ा समीपस्थ dendrites में गतिविधि कुछ तैयारी में भी देखा जा सकता है, के रूप में 2 मूवी में दिखाया गया है. पढ़ें बाहर नेटवर्क गतिविधि के वाणिज्यिक या घर में सॉफ्टवेयर स्क्रिप्ट का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. हमारी प्रयोगशाला, सेल पहचान और नेटवर्क गतिविधि में मापा और Matlab (Mathworks) के लिए घर में कोड का उपयोग कर एक अर्द्ध स्वचालित तरीके से विश्लेषण किया. चित्रा 5. एक विकासशील cortical नेटवर्क से सिंक्रनाइज़ कैल्शियम यात्रियों के प्रतिनिधि एक न्यूरॉन के 3 डी प्रतिनिधित्व (विश्लेषण . <strong> ए) करने के लिए स्वचालित रूप से स्वचालित न्यूरॉन का पता लगाने के लिए (बी) एक z-ढेर से एक न्यूरॉन मुखौटा बनाने के लिए इस्तेमाल किया. कैल्शियम यात्रियों की माप आयाम, आवृत्ति सक्रिय कोशिकाओं है कि एक न्यूरॉन डेटा (सी) से पढ़ सकते हैं और # शामिल हैं . अलग निशान के बीच synchrony एक रेखापुंज साजिश (डी) का उपयोग करते हुए कल्पना किया जा सकता है.
Discussion
तरीकों हम यहाँ दिखाने का प्रदर्शन नेटवर्क गतिशीलता और माउस में चूहा मस्तिष्क में भी cortical और hippocampal नेटवर्क के विकास के भीतर पहचान कोशिकाओं से कैल्शियम इमेजिंग के लिए उपयुक्त प्रोटोकॉल. इन विधियों इष्टतम स्थानिक संकल्प प्रदान suprathreshold गतिविधि को मापने के लिए सेल somas की एक स्थानीय नेटवर्क के साथ कल्पना. लंबी अवधि suprathreshold घटनाओं, आमतौर पर विकासशील तंत्रिका तंत्र में पाया के लिए शोर माप: नेटवर्क गतिविधि के टेम्पोरल संकल्प फ्रेम अधिग्रहण सीसीडी कैमरा सेटिंग्स पर निर्भर करता है, अनुकूलन करने के लिए संकेत हो सकता है, विभिन्न कर सकते हैं. इन प्रोटोकॉल hippocampal और cortical भी, लेकिन विकासशील तंत्रिका तंत्र भर नेटवर्क लेबल कोशिकाओं तक ही सीमित नहीं हैं. इस विधि की सीमा केवल suprathreshold गतिविधि दर्ज किया जा सकता है कि.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
प्रयोगशाला में कार्य Nederlandse Organisatie वूर Wetenschappelijk (NWO) Onderzoek RMM (917.10.372) द्वारा समर्थित है. जद यूरोपीय संघ के FP7 BrainTrain कार्यक्रम ( संबद्ध है www.brain train.nl ). हम एफपी multielectrode सरणी waveforms और वीडियो अनुक्रम में इस्तेमाल किया neuronal संस्कृतियों की छवियों के लिए लॉरेन्स Baljon और Sabine Schmitz (दोनों CNCR, VU विश्वविद्यालय एम्स्टर्डम) पीटर धन्यवाद.
Materials
| Solutions | |||
| CaCl2 | Sigma Aldrich | 22,350-6 | |
| Choline chloride | Sigma | C7527 | |
| cremaphor | Fluka | 27963 | Cremophor EL® |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | 472301 | |
| D-glucose | Sigma Aldrich | 16325 | |
| Fura-2 AM | Invitrogen | F-1221 | special packaging |
| KCl | Sigma Aldrich | 60130 | |
| MgCl2 | Fluka | 63072 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | 31437 | |
| NaH2PO4 | Merck | 106346 | |
| Pluronic® F-127 | Invitrogen | P-3000MP | 20% solution in DMSO |
| sodium ascorbate | Sigma | A7631 | |
| sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | |
| Lectin from Lycopersicon esculentum (tomato) | Sigma | L0401 | |
| Sulforhodamine 101 acid chloride | Sigma | S3388 | |
| Poly(ethyleneimine) solution | Fluka | P3143 | |
| boric acid | Sigma | B6768 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Sigma | B3545 | |
| PEI | |||
| Staining chamber | |||
| Syringe (5 or 10 ml) | Terumo | with luer lock | |
| Cell Culture Inserts for 6-well plates, 8.0 µm, transparent PET membrane | BD Falcon™ | 353093 | |
| Petri dish (35 and 100mm) | disposable, polystyrene | ||
| tubing and connectors | |||
| super glue | |||
| Holders and Chambers | |||
| Slice holder | submerged | ||
| Staining chamber | interface chamber | ||
| recording chamber | e.g. MEA probes | ||
| Imaging setup | |||
| Titanium Sapphire laser (Chameleon) | Coherent | ||
| Trim Scope | LaVision | 64 beams | |
| Microscope | Leica | High NA lense |
References
- Katz, L. C., Shatz, C. J. Synaptic activity and the construction of cortical circuits. Science. 274, 1133-1138 (1996).
- Khazipov, R., Luhmann, H. J. Early patterns of electrical activity in the developing cerebral cortex of humans and rodents. Trends in Neurosciences. 29, 414-418 (2006).
- Spitzer, N. C. Electrical activity in early neuronal development. Nature. 444, 707-712 (2006).
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Functional Calcium ImagingDeveloping Cortical NetworksSynchronized Network ActivitySpontaneous ActivityDepolarizationVoltage-gated Calcium ChannelsSynchronized Electrical ActivityField ElectrodesPatch-clamp ElectrophysiologyCalcium-dependent Fluorescent Indicator DyesSpatial ResolutionTemporal Sampling
Citer Cet Article
Dawitz, J., Kroon, T., Hjorth, J. J., Meredith, R. M. Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks. J. Vis. Exp. (56), e3550, doi:10.3791/3550 (2011).