Skeletal Muscle Gender Dimorphismus von Proteomics

1. Probenvorbereitung Verwenden Sie frische, schockgefroren oder RNAlater behandelten Gewebe von Mäusen als Ausgangsmaterial. Blot entfernt überschüssiges Konservierungsmittel mit einem Kimwipe bevor Sie fortfahren. Entfernen Sie alle Sehnen und Faszien um die Muskel-und Hackfleisch, das Gewebe mit einschneidig Rasierklingen für 2 min auf gekühlten Glasplatten in einem kalten Raum (4 ° C), bis das Gewebe ist gut gehackt oder pulvrig. Sammeln Sie die Probe in einem vorher gewogenen Mikrozentrifugenröhrchen und bestimmen das Gewicht des Gewebes. Verwenden Sie nicht mehr als 10 mg des Gewebes als Ausgangsmaterial. Add 45 ul Extraktionspuffer (8 M Harnstoff, 50 mM DTT, 4% CHAPS, 0,2% Trägerampholyte 5 / 8, 0,0002% Bromphenolblau) pro 1 mg zerkleinerte Gewebe, bei Raumtemperatur. Wenn das Volumen größer ist als 350 &mgr; l, 350 &mgr; l hinzufügen und homogenisieren zunächst (Schritt 1,4), dann den Rest des Puffers zu spritzen zu minimieren. Homogenisieren des Gewebes sieben Mal mit einem motorisierten Stößel (Kontes Corp) für 15 Sekunden bei4 ° C, mit 2 Minuten auf Eis zwischen den einzelnen Homogenisierung. Zentrifugieren Sie die Proben bei 15.600 xg für 30 Minuten bei 4 ° C. Speichern Sie den Überstand und messen das Volumen. Die Zelltrümmer Pellet wird verworfen. Fällung der Proteine ​​im Überstand mit eiskaltem Reagenz-grade Aceton (3 mal v: v-Verhältnis). Beide Röhrchen für 15 Sekunden. Zentrifuge für 15.600 xg für 10 Sekunden, um Pellets zu bilden, und resuspendieren in Extraktionspuffer mit dem Kontes Motor-und Polypropylen-Rührstäbe (BioSpec Prod) Wiederholen Sie Schritt 1.6. Entweder mit Proteinkonzentration Schätzung der Proben gehen oder speichern Sie sie bei -20 ° C. 2. Protein-Konzentration Schätzung Verwenden Sie das Lowry-Assay 7 oder dem BCA-Assay 8 (Pierce); Ziel für etwa 4,5 mg ml -1. 3. Die isoelektrische Fokussierung Entfernen einer ReadyStrip IPG-Streifen (11 cm, pH 5-8, Bio-Rad)von -20 ° C und lassen Sie ihn bei RT für 10-15 min äquilibriert. Vortex der Probe und Pipette 600-800 pg (Gesamtvolumen 200 mL) von Protein Probe in einer geraden Linie an der hinteren Kante des Kanals in der Probe Rehydratation Fach, so dass etwa 1 cm an jedem Ende. Mit einer Pinzette, ziehen Sie die Plastikabdeckung der IPG-Streifen – stellen Sie sicher, dass nur die Enden des Streifens Griff und vermeiden jeden Kontakt mit dem Gel. Beachten Sie die grundlegenden Ende des Streifens und positionieren Sie es auf der linken Seite des Fachs. Legen Sie die IPG-Streifen-Gel-Seite nach unten auf der Oberseite der Probe zu vermeiden Trapping Blasen darunter. Lassen Sie es eine Stunde rehydrieren. Overlay mit 2,5 ml Mineralöl (BioRad). Decken Sie die Schale mit dem Deckel und lassen Sie über Nacht rehydrieren bei Raumtemperatur. Ein Papier-Docht an beiden Enden der Schwerpunkt-Fach-Kanal und nass jeweils mit 10 l Millipore-Wasser. Nehmen Sie IPG-Streifen und vertikal halten für etwa 10 Sekunden den Öl ablassen. Blot der Kunststoff-backing mit einem Kimwipe. Legen Sie die IPG-Streifen Gel nach unten und mit grundlegenden Ende nach links in die Fokussierung Fach. Bedecken Sie den Streifen mit 2,5 ml Mineralöl. Legen Sie das Fach in den PROTEAN IEF-Zelle (Bio-Rad) und Programmierung einer 3-Schritt-Protokoll (Tabelle 1) bei Standard-Zell-Temperatur von 20 ° C, einem maximalen Strom von 50 uA / Streifen und keine Rehydrierung Zeit. Spannung Zeit Volt-Hrs Rampe Schritt 1 250 20 min Linear Schritt 2 8.000 2,5 h Linear Schritt 3 8.000 40.000 Schnell Gesamt 6,5 Std. 40.000 Tabelle 1. Drei-Schritt-Protokoll PROTEAN IEF-Zelle für 11 cm IPG-Streifen. Nehmen Sie die IPG-Streifen aus dem IEF-Zelle mit einer Pinzette. Blot die Kunststoff-Abdeckung mit einem Kimwipe und Ort der IPG-Streifen-Gel nach oben in eine saubere Rehydratation Fach. Sie können decken die Rehydratation Tablett und wickeln Sie es mit Plastikfolie bedecken und bei – 80 ° C oder fortzufahren. 4. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese Übertragen Sie die Streifen (Gel-Seite nach oben) in einen 11 cm Equilibrierung Fach. 4 mL Reduktion Puffer (6 M Harnstoff, 2% SDS, 0,05 M Tris / HCl pH 8,8, 20% Glycerin, 2% DTT), um den Kanal und Äquilibrierung der Streifen für 10 min mit einer leichten Schütteln. Entfernen Sie die Reduktion Puffer, 4 ml Alkylierung Puffer (6 M Harnstoff, 2% SDS, 0,05 M Tris / HCl pH 8,8, 20% Glycerin, 2,5% iodoacetamide) und äquilibrieren der Streifen für 10 Minuten mit milden Schütteln. Spülen Sie den IPG-Streifen durch Eintauchen des strip kurz in 1 X SDS Laufpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1% SDS, pH 8,2). Legen Sie den Streifen-Gel nach oben auf die Rückwand des 11 cm Criterion pre-cast 10,5% -14% Tris-HCl SDS-Polyacrylamidgel (Bio-Rad) und mit leichtem Druck, so dass er vollen Kontakt mit dem SDS-Gel macht; sicherstellen, dass keine Luftblasen zwischen den beiden Geloberflächen gefangen sind. Overlay der IPG-Streifen mit 1 ml geschmolzene Agarose-Lösung (0,5% Agarose, 25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1% SDS, Bromphenolblau) und lassen Sie die Agarose für 5 Minuten erstarren. Legen Sie 5 ul Protein-Marker 10-225 kDa (USB, P / N: 76.740) in den einzelnen sowie Molekulargewicht-Standards. Führen Sie das Gel in SDS-Puffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1% SDS, pH 8,2) bei 200 V bei Raumtemperatur oder in einem kalten Raum (4 ° C) mit Hilfe der Bromphenolblau Farbstoff vor der Migration auf die Elektrophorese zu überwachen. Entfernen Sie das Gel aus dem Plastikbehälter gegossen und Flecken über Nacht unter leichtem Schütteln in Coomassie Brilliant BlueR-250-Färbung (45,5% Methanol, 45,5% dH2O, 9,0% Essigsäure, 0,25% Coomassie Brilliant Blue R-250). Schütteln Sie das Gel in Entfärben 1-Lösung (45,5% Methanol, 45,5% dH 2 O, 9,0% Essigsäure) zweimal für jeweils 3 Stunden und in Entfärben 2 (5% Methanol, 90% dH 2 O, 5% Essigsäure) über Nacht. Bewahren Sie das Gel in 7% Essigsäure für die Analyse. 5. Gel Imaging und Analyse Machen Sie Bilder der Gele mit der Quantity One-Software-Programm, das VersaDoc Imaging-System (BioRad) betreibt. Schneiden Sie das Bild Bereichen einheitlich für alle Gele in Ihr Experiment. Laden Sie das beschnittene Bilder auf der PDQuest 8.0 Software-Programm, ein Experiment zu erstellen. Folgen Sie dem Experiment Setup-Assistenten, um die Parameter für Spot-Erkennung und Spotmatching über die Gele zu definieren. Überprüfen und verfeinern die Stelle passenden Ergebnisse manuell, wenn nötig. Führen Sie quantitative und statistische Analyse der Gele angepasst Proteinspots mit tw erkenneno-fach oder höher statistisch signifikanten Unterschiede in der Expression zwischen den beiden Gruppen Gel. Erstellen Sie eine Analyse mit diesen Stellen von Interesse setzen und schneiden Sie sie mit einem EXQuest Spot Cutter (BioRad) für Trypsinverdauung und LC-MS-basierten Protein-Identifizierung. 6. In-Gel-tryptischen Verdau Für diesen Schritt eine modifizierte Pierce In-Gel Tryptic Digest Kit (# 89871X, Pierce)-Protokoll verwendet wird. Geben Sie 200 ul der Entfärbelösung (25 mM Ammoniumhydrogencarbonat, 50% Acetonitril) auf das Gel Stecker. Vortex und Inkubation der Proben bei 37 ° C für 30 Minuten unter Schütteln. Entfernen und entsorgen Sie die Lösung. Wiederholen Sie Schritt 6.1. Add 30 ul frisch zubereiteten reduzierendem Puffer (50 mM Tris [2-carboxy] Phosphin, 22,5 mM Ammoniumhydrogencarbonat), um die Rohre mit dem Gel-Stecker und Inkubieren bei 60 ° C für 10 Minuten. Die Proben zu kühlen, dann entfernen und die Verringerung der Puffer. Add 30 ul Alkylierung Puffer (100 mM iodoacetamide, 20 mM Ammoniumhydrogencarbonat, unmittelbar vor der Verwendung in Folie Röhrchen vorbereitet. Inkubieren Sie die Proben im Dunkeln bei Raumtemperatur für 1 Stunde. Entfernen und entsorgen Sie die Alkylierung Puffer. Waschen Sie die Gel-Stecker durch Zugabe von 200 ul der Entfärbelösung in jedes Röhrchen. Inkubieren Sie die Proben bei 37 ° C für 15 Minuten. Entfernen und Entsorgen der Entfärbelösung und wiederholen Sie die Wäsche. Add 50 ul Acetonitril auf das Gel Stecker und inkubieren Sie sie 10 Minuten bei Raumtemperatur, damit sie zu schrumpfen trocken, dann vorsichtig den Acetonitril. Wiederholen Sie Schritt 6,8 Mal mehr. Gel Stücke aussehen soll weiß und klein. Lassen Gelstücke in einem CentriVap Concentrator (Labconco, Model EX1245) für 10 Minuten trocknen lassen. Swell Gel Stücke durch Zugabe von 10 ul der aktivierten Trypsin-Lösung (10 ng / ul Trypsin, 25 mM Ammoniumhydrogencarbonat). Inkubieren bei Raumtemperatur für 15 minuten. Add 25 ul Verdauung Puffer (25 mM Ammoniumhydrogencarbonat), um die Rohre. Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei Raumtemperatur unter Schütteln. Beschallen die Proben für 10 Minuten (Branson, Ultraschallbad Modell 2510) und Spin sie nieder, bevor Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen. Speichern Sie den Überstand. Zur weiteren Auszug Peptide, mit 10 &mgr; l 0,1% iger Ameisensäure und Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln. Beschallen die Proben für 10 Minuten, den Überstand und verbinden sich mit gespeichert Überstand in Schritt 6.13. 7. Microscale Entsalzung von Peptid-Extrakte Entfernen Ammoniumbicarbonat und andere Salze in der Peptid-Extrakte mit Hilfe von PepClean C-18 Spin Columns (ThermoFisher) nach Anweisungen des Herstellers. Eluieren Peptide zweimal mit je 20 ul 70% Acetonitril, verdunsten die Proben trocken durch Zentrifugation in der CentriVap Concentrator für 1 Stunde und resuspendierendie Peptide in 10 ul 0,1% Ameisensäure für MS-Analyse. 8. Protein Identifikation mittels HPLC-gekoppelte Massenspektrometrie Separate 5 ul der Peptidmischung auf einem Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) über 40 Minuten, mit einem linearen 2-50% Acetonitril-Gradienten mit 0,2% iger Ameisensäure auf einer Pepswift monolithischen PS-DVB-Säule (Dionex), um eine Nanospray gekoppelt I Quelle auf eine Ionenfallen-Massenspektrometer (LCQ Deca XP Max, Thermo Fisher Scientific) bei einer Flussrate von 400 nl / min an der Spitze. Detect-Peptid MS1 Signale zwischen 400 bis 1400 m / z und lassen für die 3 stärksten Ionenpeaks für MS2 Sequenzierung von CID mit dynamischen Ausschluss isoliert werden. Für Protein-Identifizierung, Analyse der Peptid-Ergebnisse über eine Sequest Maus Referenzdatenbank Suche (BioWorks Software, Thermo-Fisher Scientific) mit einer statischen alkylierten Cystein Modifikation und dynamische Änderungen für die Phosphorylierung (Serin, Threonin, Tyrosin), Methylierungnung (Histidin), Oxidation (Methionin), ADP-Ribosylierung (Arginin) und N-terminale Acetylierung. Übernehmen konservativen Matching-Kriterien (zB Peptid-Toleranz auf 2 AMU und 1,00 Fragment Toleranz, Proteine ​​enthalten mindestens 2 Peptide Übergabe eines Xcorr vs Charge State-Filter [z = 1 / x = 1,5, z = 2 / x = 2,00, z = 3 / x = 2,50, z = 4 / x = 3,00] und einer Wahrscheinlichkeit von p <0,05) 5 und manuell überprüfen Sie die MS-Spektren für die selbstbewusste Identifizierung von Proteinen. 9. Repräsentative Ergebnisse: Männliche und weibliche unexercised wurde murinen Skelettmuskel (Bizeps) extrahiert und in eine zweidimensionale Karte 5, die erste Stufe des Muskels vergleichenden Proteomanalyse (Abbildung 2). Sobald visualisiert mittels hochauflösender Digital Imaging, ca. 800 Proteinspots wurden in jedem erkannt. Die männliche Proteom Karte als Grundlage, ist es klar, dass es zahlreiche Punkte, die in Hülle und Fülle Veränderung in der weiblichen Proteom. Der Spot-Intensitäten werden Maßnahmen der Veränderung des entsprechenden Proteins Mengen (Abbildung 3). Die Identität der Protein-Spots, die mehr als zwei-fach (nach oben oder unten) zu ändern und sind statistisch signifikant (p <0,05) mit einem n = 5 Mäusen werden durch Aminosäure-Sequenz-Analyse mit Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektrometrie ermittelt. Diese Ergebnisse zeigen, dass Frauen eine Fülle Rückgang der Zucker Energiestoffwechsel Enzyme und der Kreatinkinase-Enzym (CK)-Isoformen, eine andere Energieversorgung in den Muskeln zu demonstrieren. Mensch und Tier Display höhere männliche Serum CK-Werte in Ruhe und nach dem Training 9,10, aber CK-Werte nicht unbedingt mit der Höhe der myofibrillären Störung 11,12 korrelieren. Diese geschlechtsspezifischen Dimorphismus in der zellulären Fülle von CK in murine biceps brachii ist ein neuartiges finding5 und kann die physiologisch verschiedene CK-Werte zu beantworten. Fakten: g1.jpg "/> Abbildung 1. Eine allgemeine Schema des Protokolls für die vergleichende Proteomik. ; Analyse von Proben, und Identifizierung von Proteinen Probenvorbereitung: Das Protokoll ist in drei Gruppen unterteilt. Die Enden jeder dieser drei Gruppen von Protokollen sind auch angemessene Pausen Orten, obwohl die besten Ergebnisse sammelte werden, wenn die gesamte Protokoll wird ohne Unterbrechung durchgeführt. Abbildung 2. Vergleich der weiblichen Maus Bizeps Proteinspots gegenüber der identischen Stellen im männlichen Bizeps (grüne Kreise o). Spots, die größer oder gleich zweifach bei Frauen erhöht werden eingekreist rot (o) und diejenigen, die weniger als oder gleich zweifach zurückgegangen sind eingekreist blau (o). Abbildung 3 Gel Spot Intensity Analysis:. X-Achse, weiblichvor dem Training (Kontrollgruppe, n = 5); Y-Achse, weiblich einzigen Kampf 0 Std. Zeitpunkt Gruppe (n = 5). Regressionsgerade: Korrelationskoeffizient = 0,919; Steigung = 0,976; abzufangen = -0,0293. Spots über der roten Linie und unterhalb der blauen Linie zu ändern mehr als + / – zwei-fach.