Endojen NADH Floresans iki-foton Imaging tarafından Fare Serebral Korteks olarak Microregional Hipoksi Algılama
Summary
Burada doğrudan fare kortekste microregional doku hipoksisi görselleştirmek için bir yöntem tarif<em> In vivo</em>. Bu nikotinamid adenin dinükleotid (NADH) ve kortikal mikrodolaşım eşzamanlı iki-fotonlu görüntüleme dayanmaktadır. Bu yöntem, doku oksijen kaynağının, yüksek çözünürlükte analizi için yararlıdır.
Abstract
Metabolik talebin yüksek düzeyde çalışabilmesi için beyin yeteneği kan akımı ve doku oksijen difüzyon yoluyla sürekli oksijen kaynağı bağlıdır. Burada doğrudan microregional doku hipoksisi görselleştirmek için ve fare kortekste perivasküler oksijen gradyanlar anlaması için bir görüntülenmiştir deneysel ve metodolojik protokolü sunarız. Bu nikotinamid adenin dinükleotid (NADH) endojen floresans yoğunluğu ve doku NADH floresans aniden 10 mmHg 1'in altına doku oksijen düzeyleri artar gözlenen doku, oksijen kısmi basıncı arasındaki doğrusal olmayan ilişki dayanmaktadır. Biz Texas-Kırmızı dekstran ile kıyasladı içsel NADH doku floresans ve plazma eşzamanlı uyarım sağlayan 740 nm'de iki foton uyarması kullanın. Mevcut yaklaşımlar üzerindeki bu yöntemin avantajlarını aşağıdakileri içerir: bir iç doku sinyali yararlanır ve in vivo im standart iki-fotonlu kullanılarak yapılabilirekipmanı yaşlanma; bu ~ 50 um arasındaki bir derinliğe sahip çözünürlüğü görüş tüm alan sürekli izleme izin verir. Biz serebral kan damarlarından uzak beyin dokusu alanları vasküler oksijen kaynağı yaşanan düşüşün ardından işlevsel hipoksik olmak için ilk olarak hassas sınır alanlarda karşılık göstermektedir. Bu yöntem, görüntü microregional kortikal oksijen bir sağlar ve dolayısıyla nörovasküler hastalıklar ve inme yetersiz veya kısıtlı doku oksijen kaynağının bir rol incelenmesi için yararlıdır.
Protocol
Discussion
Oksijen difüzyon hakkında yüksek uzaysal çözünürlüğü bilgilerin beyindeki kan akışını beyin hücreleri için oksijen sağlamak, ve metabolik talebi karşılamak için nasıl düzenlendiği anlamak için önemlidir. Clark-tarzı cam elektrotlar kullanılarak Geleneksel polarografik oksijen ölçümleri invaziv ve düşük uzaysal çözünürlüğü 2-3 ve önemli (ikinci aralık) tepki süresine sahip. Şimdiye kadar beyin dokusunda pO 2 ölçmek için sadece non-invaziv yöntem heyecanlı prob çürüme oranı oksijen konsantrasyonu 4 orantılıdır fosforesans su verme vardır. Bu yöntem, doğru oksijen konsantrasyonu sağlar, ancak özel bir boya ve bir teknik olarak gelişmiş fosforesans ömrü görüntüleme sistemi gerektirir. Burada, iki flurescence kanalları ile standart bir iki foton görüntüleme sistemi üzerinde yapılabilecek basit, basit bir yaklaşım göstermektedir. Bizim yaklaşımımız içsel bir doku sinyali 5 yararlanırnd sadece kortikal mikrodolaşımında zıt görselleştirme gerektirir. Çünkü fonksiyonel oksijen konsantrasyonu 1 sınırlamaya NADH floresans doğrusal olmayan, esasen ikili artış, içsel NADH floresan tek anlamlı, metabolik sınırlayıcı hipoksi ile yerlerde görülmektedir arttı. Önemli bir ima kortikal mikrodamarlar oksijen difüzyon doku sınırları doğrudan endojen NADH floresans silindirik şeklindeki yoğunluğu değişiklikler gözlenebilir olmasıdır. Bir kan damarı çevreleyen doku oksijenli hacmi tanımlamak silindirik şeklindeki yapılar kavramı Ağustos Krogh tarafından ortaya atıldı ve son zamanlarda deneysel iki-foton NADH görüntüleme 1 kullanarak gözlenmiştir, çünkü Krogh silindir gibi bu yapıların bakın. Krogh silindir görüntüleri görüntü kareleri bir z-yığını alarak 3D toplanabilir. Bunlar delici arteriyoller çevresinde, özellikle belirgin olup münasip wit olanh tükenmiş periarteriolar doku silindir 1,4 kısımdır.
Krogh doku silindirin yarıçapı R objektif bir tespiti (Bölüm 5.2) biz silindir merkezi ve Matlab işlevi "improfile" kullanarak dış sınırı arasındaki iyi tanımlanmış bir kesimi içinde radyal piksel yoğunluk değerleri ölçülür sağlamak. Segmentin dış sınır görünür sınır ötesinde bir güvenlik payı ile genişletmek için tercih edilmelidir. Sinyal-gürültü düzeyini geliştirmek için biz 1 ° adımlarda görünür silindir kesimi kapsayacak şekilde gerekli tüm radyal hatları üzerinden averageed. Segmenti içinde çıkan ortalama radyal yoğunluk profili görünür doku sınır R karşılık dik bir artış sergiledi. Biz ortalama radyal yoğunluk profili için bir sigmoid fonksiyonu (örn. Boltzmann fonksiyonu) uyacak ve R bir tanımı olarak dönüm noktası (ayrıca x 0 olarak da bilinir) kullanılır. Karşılık gelen iki-pHoton microangiography (Texas-kırmızı) silindir merkezinde bir tek merkezi damar ve kesiti göstermektedir. Merkezi damar çapı doğrudan r belirlemek için de uygulanabilir.
İki foton NADH görüntüleme kortikal microangiography eş zamanlı yüksek çözünürlüklü görüntüleme aynı uzaysal çözünürlüğü sağlar. Bu yöntemin kantitatif uygulama için önemli bir özelliği, p NADH floresans artış 50 3.4 arasında olduğu ölçülmüştür olmasıdır ± 0.6 mm Hg 1 ve 2 microregional doku pO bir fonksiyonu olarak NADH floresans yoğunluğunu matematiksel olarak tarif edilebilir bir sigmoidal fonksiyonu. . Bu tekniğin bir hipoksi (% 10 havadaki oksijen miktarının azalmasıyla tarafından) en savunmasız olduğu beyin alanları belirlemesine olanak sağlar göstermektedir. Biz de oksijen difüzyon basit bir geometrik perivasküler bir yol izler olduğunu göstermektedir.
Bir critBu yöntem için ical adım kraniyal pencere hazırlık kalitesidir. Cerrahi maruz bölgeye kan akışını rahatsız etmemek için asgari zararla üretmek gerekir. Bir endişe bir cerrahi tehlikeye hazırlanmasında, pencerenin altında kortekste anlamlı bir deney engellediği bilgisi, başlamak için hipoksik olabilir olmasıdır. İyi hazırlanmış kafa penceresi tüm gemi tiplerinde canlı kan akımı ve kenarlarında belirgin kanama ile bozulmamış büyük ve küçük kan damarları olmalıdır. Normoksik koşullar altında (PaO2 80-100 mmHg, Sp O2% 97-99) beyin dokusunda yüksek NADH floresan ile göze çarpan, parlak doku yamalar olmadan tek tip, homojen NADH floresan sergilemesi gerekir.
Bizim yaklaşım temel bir fiziksel kısıtlama derinlemesine nüfuz sınırlıdır. Beyinde mavi-yeşil NADH floresans bu dalga boylarında hemoglobin emilimi ve doku saçılma hızla azalırlar. Hatta yüksek sayısal açıklık ile (örneğin 1.05) suDaldırma amaçları iki-fotonlu NADH görüntüleme anda kortikal tabakalar I ve II ile sınırlıdır. Ya da beyaz cevher yakınlık enerji metabolizmasını olasılıkla gri madde farklı olacaktır, çünkü bu sınırlama bilimsel olarak geçerlidir. Bununla birlikte, bu tabakalar IV-VI ya da beyaz madde yolları veya striatum olarak subkortikal yapılar gibi derin kortikal yapıların incelenmesi olarak vivo 6 fare korteksi açıklanan özel mikromercekten kullanımını gerektirir.
Bu tür fonksiyonel hiperemi ve kapiller akı oranlarının tespiti 7 analizi gibi diğer ölçümler ile bir araya geldiğinde oksijen difüzyon sınırları NADH tabanlı ölçümü özellikle yararlı olabilir. Örneğin, bu teknik felç, Alzheimer hastalığı (AD) modellerinde hipoksi canlandırmak için adapte edilebilir. Oksijen difüzyon basit bir geometri bir kapiller yoğunluk de olduğu koşullarda mikrovasküler yatak oksijen gradiyenti tahmin sağlar8 (örneğin, MS 9) artmış ve azalmış kapiller yoğunluğu ile beyin dokusu bölgelere microstrokes nedeniyle hipoksi hasar riski olup olmadığını incelemek. Dokunun hipoksi ve müteakip nöronal ölüm ya da kılcal remodeling 10 arasındaki görüntü yeteneği microregionally ayrıca bir doku microstrokes geometrisi ve boyutu incelemek ve hipoksi oluştuğu doku hacmi belirlemek için olanak sağlar, hem de ilişki.
Endojen NADH floresans artışlar akut mitokondriyal disfonksiyon doğrudan sonucu olduğundan Son olarak, bu yöntem sinir enerji metabolizması 11 ve mitokondriyal disfonksiyon için bir proxy için belirli bir muhabir olarak NADH görüntüleme kullanma fırsatı yaratıyor.
Sonuç olarak, endojen NADH floresans iki-fotonlu görüntüleme hem normal altında beyinde oksijen ve tüketim anlamak için kullanılabilecek bir basit, talepkar olmayan bir araçtırve patolojik eyalette.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz kafa plaka tasarımı için Dr Maiken Nedergaard (Rochester Üniversitesi Tıp Fakültesi) teşekkür ederim. Iş SD (R01DA026325 ve P30AI078498 ve KK (DANA vakıf Beyin ve Immunoimaging programı, Amerikan Kalp Derneği 0635595T ve ALS Derneği [# 1112)] için vakıf bursları) ile NIH tarafından desteklenen ödül olmuştur.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Heating pads | Beyond Bodi Heat | ||
| Ophthalmic ointment (Artificial tears) | Pfizer | ||
| Povidone-iodine 10% solution | Betadine | ||
| Ferric chloride 10% solution | |||
| Cement | Stoelting Company | 51456 | |
| Cyanoacrylate 454 | Loctite | ||
| aCSF | Harvard Apparatus | 597316 | |
| Microtorque II handpiece kit | Pearson | R14-0002 | |
| IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | |
| Forceps #5 | Fine Science Tools | 11295 | |
| Forceps #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| #0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | HC125-02 | |
| Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Spectra-Physics |
References
- Kasischke, K. A. Two-photon NADH imaging exposes boundaries of oxygen diffusion in cortical vascular supply regions. J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 31, 68-81 (2011).
- Ndubuizu, O., LaManna, J. C. Brain tissue oxygen concentration measurements. Antioxid. Redox. Signal. 9, 1207-1219 (2007).
- Sharan, M., Vovenko, E. P., Vadapalli, A., Popel, A. S., Pittman, R. N. Experimental and theoretical studies of oxygen gradients in rat pial microvessels. J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 28, 1597-1604 (2008).
- Sakadzic, S. Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue. Nat. Methods. 7, 755-759 (2010).
- Vishwasrao, H. D., Heikal, A. A., Kasischke, K. A., Webb, W. W. Conformational dependence of intracellular NADH on metabolic state revealed by associated fluorescence anisotropy. J. Biol. Chem. 280, 25119-25126 (2005).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 15741-15746 (1998).
- Brown, W. R., Thore, C. R. Review: cerebral microvascular pathology in ageing and neurodegeneration. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 37, 56-74 (2011).
- de la Torre, J. C. Impaired brain microcirculation may trigger Alzheimer’s disease. Neurosci. Biobehav. Rev. 18, 397-401 (1994).
- Brown, C. E., Boyd, J. D., Murphy, T. H. Longitudinal in vivo imaging reveals balanced and branch-specific remodeling of mature cortical pyramidal dendritic arbors after stroke. J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 30, 783-791 (2010).
- Wilson, D. F., Erecinska, M., Drown, C., Silver, I. A. The oxygen dependence of cellular energy metabolism. Arch. Biochem. Biophys. 195, 485-493 (1979).
