La détection de l'hypoxie dans le cortex de souris microrégionale cérébrale par imagerie à deux photons de fluorescence endogène NADH

1. Préparation de l'animal pour l'imagerie Remarque: Nous utilisons des souris adultes C57BL. Différentes souches transgéniques peuvent être utilisés en fonction de la question de recherche. Chirurgies microvasculaires et l'oxymétrie de pouls sont facilitées chez la souris avec de la fourrure blanche (par exemple FVB souche). Préparer le site chirurgical sur le banc. Tous les instruments chirurgicaux doivent être autoclavés ou désinfectés avec de l'éthanol 70%. Insérez une sonde rectale, et mesurent en permanence la température du corps de l'animal tout au long de la procédure Anesthésier la souris en utilisant d'abord 5% d'isoflurane. En 15-30 s, lorsque l'animal ne se déplace pas, placez-le sur un coussin chauffant (37 ° C), et d'appliquer un masque pour l'administration continue de l'air contenant 1.3 à 1.5% d'isoflurane). Assurez-vous que l'animal ne répond pas à un stimulus douloureux (pincement de la queue, par exemple). Utilisez artificielle gel lacrymogène pour couvrir les yeux de la souris, pour prévenir l'exposition à l'air sec. Utiliser un rasoir électrique, retirez f cheveuxrom de la tête et des deux cuisses. Appliquer épilateur (par exemple Nair) à la cuisse pendant 2 min, puis essuyez-le soigneusement pour éliminer le reste des cheveux. Cette cuisse sera utilisée pour l'oxymétrie. Désinfecter le cuir chevelu avec un 10% de povidone-iode solution et l'éthanol à 70%. 2. Préparation de la fenêtre ouverte du crâne crânienne À partir de 5 mm caudale du crâne, faire une incision dans le cuir chevelu avec des ciseaux, et de faire avancer d'un centimètre. Déplacer la peau sur les côtés pour exposer le crâne. Pour supprimer les membranes sur le dessus du crâne appliquer 10% de solution de chlorure ferrique vers le haut du crâne. Essuyez l'excès de solution, et gratter les membranes loin avec 45 ° d'angle # 5 pincettes. Il est important de préparer soigneusement le site, afin de veiller à ce que la plaque de tête peut être solidement fixé sur le crâne (étapes n ° 4 à 6). En utilisant un microscope à dissection, identifier la zone d'intérêt. Notez que les sutures crâniennes devrait être évité parce que la c crâneune rupture imprévisible le long de ces lignes. Appliquez une fine couche de colle rapide (par exemple Locktite 454) sur les bords de la fenêtre de la plaque de la tête (figure 1). Positionner la plaque de tête de telle sorte que la zone d'intérêt est exposée dans la fenêtre. Appliquez une légère pression sur la plaque de tête. Appliquez une petite quantité de ciment dentaire pour polymériser la colle rapide. Maintenez la position pendant 10 secondes pendant que la colle est de polymérisation. Appliquer une petite quantité de colle rapide sur les bords de la fenêtre pour sceller la plaque de tête et le crâne. Vissez la plaque de tête à la porte des animaux dans le champ d'application de dissection. Aide de la perceuse Microtorque II a fixé à 6000 rpm et un peu IRF de forage 005, enlever toute trace de colle supplémentaire à partir du crâne et de la plaque de la tête. Toute la colle restant sur la plaque de tête devrait être supprimée, car elle sera autrement interférer avec la fixation de la couverture en verre. Réglez la perceuse à 1000 rpm, et commencer à forer le crâne en faisant un cercle intérieur de la fenêtre plaque de tête, diamètre ~ 5 mm. Utilisez lissages légers, comme si vous dessinez avec un crayon très doux. Arrêter le forage toutes les 20-30 secondes pour enlever la poussière d'os à l'aide d'air comprimé. Note: La forme de l'ouverture dans la plaque de tête permet un accès supplémentaire pour la foret (pour le chirurgien-gauche et à droite), ce qui rend plus facile pour créer une fenêtre circulaire crânienne. En outre, les deux impairs trous en forme de fournir l'espace nécessaire pour insérer une électrode de Clark-ou en verre-électrode dans le tissu cérébral sous la fenêtre crânienne pour d'autres mesures polarographiques ou électrophysiologiques. Comme le forage progresse, un terrier est formé autour du crâne intact dans le centre. Veillez à ne pas piquer à travers le crâne amincie, mais pour faire de ce terrier de même épaisseur. Soyez prudent supplémentaire autour de sang gros vaisseaux-ils ne devraient pas être compromise et, si possible, même pas touché. Utiliser l'un "jambe" de pincettes N ° 3 pour soulever ("feuilleter OFF") de l'os dans le centre de la fenêtre. Appliquez une goutte de Artificial liquide céphalo-rachidien (ACSF) sur la fenêtre. Essuyez doucement à l'aide aCSF un coin de mouchoir en papier doux (par exemple Kimwipe). Habituellement, la durée est endommagé dans un ou plusieurs endroits à travers le bord de la fenêtre. À partir de l'un de ces sites, soulevez doucement, puis retirez la durée de la surface du cerveau, en utilisant des pinces angle de 45 ° N ° 5. Au moment de choisir le site à partir duquel commencer à enlever la dure-mère, éviter les zones adjacentes aux gros vaisseaux sanguins. En cas de saignement, appliquez une goutte de aCSF et attendre pendant 2-3 min pour un saignement mineur pour arrêter. Préparer 0,07% bas point de fusion d'agarose dissous dans aCSF) Amener la fondue d'agarose à la température corporelle. Essuyer l'excès de la surface de LCRa du cerveau. Verser l'agarose dans la fenêtre, et couvrir avec une lame de verre. Appuyez doucement le verre pour faire un contact entre le verre et la plaque de tête, et attendre 10-20 secondes jusqu'à ce que l'agarose est solide. Enlever l'excès d'agarose de la couverture de verre en utilisant des pinces et du papier tissu mou. Mettez une petitequantité de colle rapide autour du verre de coller le verre à la plaque de tête. Appliquez une petite quantité de ciment dentaire à solidifier la colle (Figure 1). 3. L'injection intraveineuse et la surveillance oxygénation du sang Remarque: Nous avons régulièrement utilisé dans la veine fémorale pour l'application par voie intraveineuse du Texas rouge plutôt que la veine de la queue. C'est parce que les injections veine fémorale des injections en bolus sûre et reproductible de la teinture. Activer l'animal partiellement au-dessus d'exposer l'intérieur de la cuisse gauche. Utilisez du ruban adhésif pour fixer l'animal dans cette position. Appliquer nettoyant antiseptique, puis l'éthanol à 100% à la peau. Faire une incision le long de la cuisse médiale du genou à la symphyse pubienne. Séparez les tissus mous par dissection à l'aide des pincettes n ° 5. Remplir la seringue de 1 ml avec 130 ul de Texas Red (2,5 mg / ml). Fixez une nouvelle aiguille (calibre 30), et le plier soigneusement à 30 °, en gardant le biseau vers le haut. Remplissez le wi aiguillee Texas Red solution. Sous un microscope à dissection, insérer l'aiguille dans la veine fémorale et injecter 100 ml de Texas Red. Retirez l'aiguille et appuyer légèrement sur la veine avec de la gaze pour arrêter le saignement. Fermez la peau à l'aide de suture 4-0. Pour la surveillance continue du sang SpO 2 (pour assurer l'oxygénation du sang adéquat) placer la sonde d'oxymètre à la cuisse droite (à partir de laquelle les cheveux a été retiré). 4. Imagerie biphotonique Remarque: Nous utilisons un Olympus Fluoview1000 multiphotonique système d'imagerie (debout) avec un Ti Spectra-Physics MaiTai HP femtoseconde DeepSee: Sa laser comme source d'excitation. Pour l'imagerie, nous utilisons × 10 NA 0,45 (Zeiss C-Apochromat), ou 25 × NA 1,05 (Olympus XLPlan N) de l'eau d'immersion objectifs. Nous prenons des images à 12 bits de profondeur à une résolution de 512 × 512 pixels avec un pixel temps de séjour de 2 ms. Le NADH et le Texas-Red-dextrane sont en même temps excité à 740 nm, et fluorescence est séparée de la lumière d'excitation à l'aide d'un miroir dichroïque / proche-IR bloquant la combinaison de filtres (FF665-DI01; FF01-680/SP, Semrock, Rochester, NY, Etats-Unis), divisé en deux canaux en utilisant un miroir dichroïque (505DCXRU, Chroma , Rockingham, VT, États-Unis), et filtré passe-bande (NADH-Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36). Puissance du laser mesurée après l'objectif de 10-20 mW pour l'imagerie dans la couche I et 20-50 mW pour l'imagerie dans la couche II. Transfert de la souris chirurgicalement prêt à la platine du microscope. Prenez une première image du site en utilisant la fenêtre crânienne fond clair avec un grossissement 4x pour l'utiliser comme une carte de référence pour l'enregistrement avec un plus fort grossissement à deux photons angiographies. Zoom sur la zone d'intérêt en utilisant un grossissement x 10. Sélectionnez une zone d'intérêt dans les couches corticales I ou II (jusqu'à 150 um en dessous de la surface piale). Si un plus fort grossissement est désiré, utiliser l'objectif × 25 Début de l'enregistrement de la série chronologique (Figure 2). Nous vous recommandons d'utiliser une moyenne de 3-5 cadres pour améliorer la qualité de l'image. Provoquer une hypoxémie en ajoutant N2 50% à l'air que l'animal respire. Cela portera le niveau d'O2 à 10%. Vérifiez l'hypoxémie par la surveillance des données d'oxymètre. Continuer pour enregistrer la série de temps grâce à une hypoxémie (par exemple, pour 30 secondes), et après niveau normal O2 est rétablie. Recueillir des données pour le calcul de la distribution d'oxygène par la détection, la mesure et la quantification de la zone de cylindres de tissus hypoxie et oxygénée autour des vaisseaux sanguins. 5. Informatique Déterminer la Krogh tissus cylindre de rayon R. Cela peut être fait manuellement (Figure 3) en mesurant la distance entre le centre du vaisseau sanguin et de la limite haute à laquelle la fluorescence du NADH est détecté. Sinon, utilisez le calcul enquêteur indépendant semi-automatique de détermination du rayon R tissus cylindre et le blo centraler od navire qui a été décrit précédemment 1 sous forme complémentaire et résumées dans la section discussion de ce protocole. Déterminer la zone de l'hypoxie en utilisant un logiciel d'accès ouvert d'analyse d'image, par exemple ImageJ. Pour ce faire, utiliser le signal NADH, définir un seuil qui délimite la zone de haute intensité NADH, puis de mesurer la surface avec la fluorescence des tissus élevée NADH. 6. Les résultats représentatifs La figure 2 montre une vidéo de NADH / angiographie images lors de l'hypoxémie transitoire (pour la version PDF de cette figure, les images sélectionnées ont été utilisées). La concentration d'oxygène inspiré a été abaissé de 21% à 10% pour une période de 3 min. Ce niveau d'hypoxémie induite expérimentalement est suffisante pour induire une hypoxie sévère dans le cortex cérébral. Hypoxie conduit à une augmentation de la fluorescence du NADH, d'abord dans les régions qui étaient la plus éloignée de l'irrigation sanguine artérielle. Notez le tissu NADH fortefrontières, qui représentent les limites observables de tissus diffusion de l'oxygène à partir de la microcirculation corticale. L'image de la figure 3 montre la géométrie des limites de diffusion d'oxygène entourant les vaisseaux cérébraux. Il est possible de déduire Krogh diamètres de cylindre de ces limites, comme décrit précédemment 1. Figure 1. (A) de souris avec fenêtre crânienne préparé pour l'imagerie. (B) Dimensions de la plaque de tête. Figure 2. Endogène NADH fluorescence verte visualisées avec l'imagerie à deux photons à travers la fenêtre crânienne, environ 50 um en dessous de la surface piale. Les vaisseaux sanguins sont visualisées avec Texas Red dextran. Oxygène dans l'air inhalé a été réduit à 10% pendant 3 min, puis restauré pour 21%. La barre d'échelle: 50 um. <img alt = "Figure 3" src = "/ files/ftp_upload/3466/3466fig3.jpg" /> Figure 3. Géométrie de NADH limites de fluorescence. Contour jaune montre la limite de l'hypoxie fonctionnelle; cercles bleus montrent projetées oxygénés (Krogh) cylindres. Les lignes bleues indiquent les rayons cylindre; chiffres montrent rayons en micromètres.