Scale-Up von Mammalian Cell Culture mit einem New Mehrschichtige Flask
Summary
Zellen spielen eine instrumentale und wachsende Rolle in der Forschung und der Entdeckung und Entwicklung neuer Therapeutika. Mit diesem steigenden Bedarf an größeren Anzahl von Zellen brauchen wir effizientere und effektivere Wege für den Anbau und die Ernte Anlage abhängigen Zellen. Eine mehrschichtige Kolben mit den richtigen Features können diesem Zweck dienen.
Abstract
Eine wachsende Zahl von Zell-basierte Anwendungen erfordern eine große Anzahl von Zellen. Verwendung von Single Layer T-Flaschen, die ausreichend sind während der kleinen Erweiterung kann schwerfällig, umständlich und zeitaufwendig, wenn eine große Anzahl von Zellen notwendig sind. Um diesen Bedarf, die Leistung eines neuen mehrschichtigen Zellkulturgefäß eine einfache Skala Erleichterung der Gründung von Zellen aus einschichtigen T-Flaschen werden diskutiert. Die Kolben getestet werden in 3 – und 5-Schicht-Format und damit Kultur und vollständige Wiederherstellung der drei-bis fünfmal die Anzahl der Zellen im Vergleich zur T-175 Flaschen. Ein wesentliches Merkmal der BD Multi-Flask ist eine Mischung / Equilibrierung Port, schneller ermöglicht in-vessel Mischen sowie eine gleichmäßige Verteilung von Zellen und Reagenzien innerhalb und zwischen den Schichten der einzelnen Schiffe und konsequent zu produzieren Zellen, die in einer Umgebung, die kultiviert werden können ist kongruent zu T-175 Flaschen.
Das Design dieser Multi-Flaschen ermöglicht auch convenient Pipette Zugang zur Zugabe von Reagenzien und Zellen direkt in den Kolben sowie eine effiziente Rückgewinnung von wertvollen Zellen und Reagenzien und reduziert das Risiko der Kontamination durch Gießen. Für Anwendungen, bei denen Gießen über Pipettieren bevorzugt wird, kann das Design für minimal residual Flüssigkeitsretention, um Verschwendung von wertvollen Zellen und Reagenzien zu reduzieren.
Protocol
Discussion
Die aktuelle Studie zeigt die Steigerung der Produktivität, dass die Multi-Flask Design Forschern bietet. Zwar ist es wichtig, dass die oben genannten Schritte für eine optimale Leistung skizzierte bei der Verwendung von Multi-Flaschen folgen, gibt es nur wenige kritische Schritte in diesem Protokoll, das als wichtigste sind. Dazu gehören (i) Mischen von Zellen und Reagenzien mit dem Mix-Port innerhalb des Gefäßes (ii) den Transport von Multi-Kolben bei 45 °-Winkel nach Partitionierung Flüssigkeit in jeder der Schichten (iii) zur Multi-Flask flachen post Aufteilung in Uhrzeigersinn Inkubator.
Der richtige Einsatz von Multi-Flask führt zur Produktion eines homogenen Zellpopulation innerhalb jedes Schiff, das in einer Umgebung, die kongruent zu T-175 Flaschen (5) ist kultiviert wird. Diese Schiffe verfügen über 3 und 5 mal mehr Zellen in einem ähnlichen Abmessungen wie der T-175 Kolben. Die 3 und 5-Schicht-Schiff bietet 525 und 875cm 2 von Wachstum-, respektive und bieten sowohl Platz als auch Arbeits-savings für die Nutzer. Tissue Culture Oberflächenbehandlung ist vergleichbar mit Standard-Flaschen so dass Scale-up, ohne die Notwendigkeit einer erneuten Optimierung der bestehenden Kultur Bedingungen oder Kompromisse bei der Qualität, Homogenität oder die Leistung der Zellen (6, 7). Dies bietet auch für die Vergleichbarkeit mit den zuvor gesammelten Daten. Diese Schiffe können auch mit Reagenzien wie Kollagen beschichtet werden, Fibronectin, Poly-D-Lysin an einen spezialisierten Substrat für den Anbau, Wachstum und Differenzierung von bestimmten Zelltypen wie Leberzellen 8, kertainocytes 9, Stammzellen in serum-freiem Medium gezüchtet bieten Formulierungen. Coating-Lösungen können mit minimal residual Flüssigkeitsretention entfernt werden, um Verschwendung von wertvollen Reagenzien sowie eine effektive Entfernung der Beschichtung Lösung vor der Kultivierung von Zellen zu reduzieren. Die empfohlene optimale Datenträger zur Kultivierung von Zellen in Multi-Kolben Bereich von 0,142 bis 0,287 ml / cm 2, die mit 25-50 ml pro Schicht zu übersetzen. Im Gegensatz zu anderen vielschichtigen Kolben, tseinem Produkt bietet eine Mischung-Port in das Gefäß, das eine schnelle in-vessel Mischen sowie eine gleichmäßige Verteilung von Zellen und Reagenzien innerhalb und zwischen den Schichten der einzelnen Schiffe ermöglicht. Diverse Zelllinien, primären Kulturen und Stammzellen wurden bis effizient skaliert mit Multi-Flaschen. Diese Schiffe sind besonders vorteilhaft für Anwendungen, die eine große Zahl von Zellen, wie im High-Throughput-Screening, zur Herstellung von Impfstoffen, viraler Vektor Transfektionen und Zelltherapie zu verlangen.
Einsparungen in Zeit, Raum, Arbeit und verringert das Abfallaufkommen sind der Schlüssel Gewinne der Multi-Flask im Vergleich zu herkömmlichen Kulturen in einschichtigen Behältern. Wir können Kultur etwa das Dreifache der Zahl der Zellen ab 5 geerntet, T-175 Flaschen im gleichen Raum mit 3, 5-Schicht-Multi-Flaschen. Dieser Vorteil in platzsparender ist nicht nur auf T-175 beschränkt, sondern kann auch auf andere Schiffe ausgedehnt werden: ein Standard Rollflasche Apparat, der in gemeinsamen Labor Inkubatoren Häusern passt ~ 4 roller Flaschen (2200 ml), die jeweils 850cm 2-Oberfläche zur Verfügung stellt. In der gleichen Gegend, kann ~ 20, 5-Schicht-Multi-Flaschen untergebracht wodurch fünfmal das Wachstum Oberfläche zur Kultivierung von Zellen sein. Darüber hinaus mit einem Anstieg in der "Go-Green" Bewusstsein ist Optionen, um das Abfallaufkommen zu reduzieren höchst wünschenswert. In dieser Hinsicht gibt es einen 38% (5, T-175 Flaschen wiegen ~ 640g, während einer, 5-Schicht-Multi-Flask wiegt ~ 400g) Rückgang des Abfallaufkommens mit Multi-Flaschen im Vergleich zu T-175 Flaschen und diese Vorteile führen in Abfällen Lager-und Entsorgungskosten und führen zu wirtschaftlichen Einsparungen für den Benutzer zu verringern.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalogue # | Comments |
| 3-layer Tissue Culture-treated 525cm2 | BD Biosciences | 353143 | BD Biosciences Cell Culture – BD Falcon Multi-Flasks |
| 5-layer Tissue Culture-treated 875cm2 | BD Biosciences | 353144 | |
| 100ml pipette | BD Biosciences | 357600 | |
| 10 ml pipette | BD Biosciences | 357551 | |
| 5 ml aspirating pipette | BD Biosciences | 357501 | |
| 50 ml Polypropylene conical tube | BD Biosciences | 352070 | |
| T-175 flask Tissue Culture-treated | BD Biosciences | 353028 | |
| Gram Crystal Violet | BD | 212525 | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| GMEM | Sigma | G5154 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| MEM | ATCC | 30-2003 | |
| Trypsin-EDTA | Lonza | CC-5012 | |
| Fetal Bovine serum | Invitrogen | 16000-044 | |
| Tryptose Phosphate Broth | Sigma | T8159 | |
| BHK-21 cells | Sigma | 85011433 | |
| Hep-G2, LnCAP | ATCC | ||
| Ecopack 2-293 | Clontech | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polystyrene Bead | PolySciences Inc. | 24628-20 | |
| Bio-Profile Flex Analyzer | Nova BioMedical |
References
- Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration mesurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab. Hematol. 10, 109-109 (2004).
- Bonnekoh, B., Wevers, A., Jugert, F., Merk, H., Mahrle, G. Colorimetric growth assay for epidermal cell cultures by their crystal violet binding capacity. Arch. Dermatol. Res. 281, 487-487 (1989).
- Sengupta, N., Rose, S. T., Morgan, J. A. Metabolic Flux analysis of CHO cell metabolism in the late non-growth phase. Biotechnol. Bioeng. 108, 83-83 (2010).
- Zhu, M. M., Goyal, A., Rank, D. L., Gupta, S. K. Effects of elevated pCO2 and osmolality on growth of cells and production of antibody–fusion protein B1: a case study. Biotechnol. Prog. 21, (2005).
- Ryan, J. M., Sharf, B. B., Cristofalo, J. The influence of culture medium volume on cell density and life-span of human diploid fibroblasts. Exp Cell Res. 91, 389-389 (2004).
- Flaherty, P. . Tips and Techniques for enhancing your cell culture. , (2009).
- Sanyal, S., Abraham, E. J., Slater, K., Cai, A., Lacey, B., Hartshorn, C., Flaherty, P., McHugh, B., Qian, S. . Scaling up cells in BD Falcon Cell Culture Multi-Flasks. , (2011).
- DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Mol. Cell. Biol. 11, 4405-4405 (1991).
- Grose, R., Hutter, C., Bloch, W., Thorey, I., Watt, F. M., Fassler, R., Brakebusch, W. S. A crucial role of β1 integrins for keratinocyte migration in vitro and during cutaneous wound repair. Dev. 129, 2303-2303 (2002).
