زرع داخل القحف مع 3d اللاحقة في فيفو Bioluminescent التصوير الاورام الدبقية الفئران

1. خلية ثقافة تم الحصول على خط الخلية GL26 من شعبة لعلاج السرطان والتشخيص (DCTD) المعهد الوطني للسرطان (NCI) ، فريدريك ، ماريلاند. لتسهيل القياس الكمي للخلايا معدل نمو الورم GL261 أدلى bioluminescent باستخدام نظام HT Lentiphos (Clontech المختبرات ، وشركة ماونتن فيو ، كاليفورنيا) مع ميكس Lenti – X تغليف HT (Clontech المختبرات ، وشركة) ، وعلى FUW GL البلازميد (هدية سخية من مختبر روبين JB ، دكتوراه في الطب ، دكتوراه). واستمرت الخلايا في متوسطة Dulbecco في التعديل النسر (DMEM) مع 10 ٪ التتراسيكلين خالية من مصل العجل الجنين (FCS ؛ Clontech المختبرات ، وشركة). كما كانت الخلايا GL261 transfected ستابلي مع الجين luc2 الترميز باستخدام pGL4.51 [luc2 / CMV / نيو] ناقلات (Promega كورب ، ماديسون ، ويسكونسن) ، والكاشف FuGENE ترنسفكأيشن 6 (روش العلوم التطبيقية ، انديانابوليس ، IN) الشروط التالية التي يحددها الشركة المصنعة. الجين luc2 هو نسخة محسنة من كودون lucifera يراعةذاتها التي توفر الانتاج أعلى بكثير من الضوء على الجين لوك القياسية. وقد تم اختيار transfectants مستقرة والمحافظة عليها في وسائل الإعلام التي تحتوي على السفح DMEM 10 ٪ و 100 ميكروغرام / مل Geneticin (G418 ، Invitrogen كورب ، كارلسباد ، كاليفورنيا). قبل زرع الخلايا يتم حصادها من قبل trypsinzation مثقف ، وغسلها مرة واحدة في DMEM بدون المصل ومعلق في DMEM دون المصل في تركيز خلايا 1 × 7 10 / مل. 2. 2 الإعداد لعملية جراحية ويحتفظ بيئة معقمة خلال عملية جراحية ، بما في ذلك جميع الأدوات الجراحية والمستلزمات ، والقفازات ، والستائر ، الخ. عشرة C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr الاسبوع القديمة (C57BL البيضاء / 6) يتم شراؤها من الفئران المعهد الوطني للسرطان في الحيوان فريدريك برنامج إنتاج واستخدام وزنها في المتوسط ​​من 20 غراما (NCI ، فريدريك ، MD). تخدير الحيوانات عن طريق الحقن داخل الصفاق من زيلازين (5 ملغ / كلغ) والكيتامين (50 ملغ / كلغ) والبوبرينورفين (0.05 ملغ / كلغ). إلىيتم ه قرصة لضمان كاف تخدير الحيوان قبل بدأ عملية جراحية. حركة (حتى لو كان طفيفا) في أي جزء من هذا الحيوان هو دلالة على وجود انخفاض في مستوى التخدير. ويرد على الفور حيوان إضافية 3.3 ملغ / كلغ و 26.6 زيلازين الكيتامين ملغم / كغم. يتم الاحتفاظ درجة حرارة الجسم باستخدام المصباح والضمادات المعقمة التي تغطي الجسم. بمجرد تخدير الحيوان بشكل صحيح ، يتم وضعها على السرير خففت من headframe المجسم (الموديل 900 الصغيرة التجسيمي الحيوان ، ديفيد Kopf الآلات) [الشكل 1]. وتطبق كمية صغيرة (1 / 4 بوصة) الدموع اكوا البصريات مرهم شحم على القرنيات. المضمون هو الحيوان في إطار المجسم عن طريق فتح فم الحيوان (عن طريق وضع السبابة والإبهام حول الفك الحيوان) ، والانزلاق على الأسنان الأمامية العليا في المسافة البادئة في الإطار المجسم. وشددت على المشبك لتأمين رأس الحيوان في الرأس والتأكد من أن اله يتم محاذاة الرأس وتتركز أعين ، والتأكد لكن ليس على ممارسة القوة لا مبرر له على رأس الحيوان. غير مسجلة في 2 O خرطوم أسفل قرب الخياشيم الحيوان. معدل تدفق الأوكسجين هو 0.5 لتر / دقيقة. غير مسجلة في أسفل الظهر والذيل وصولا الى السرير المجسم والحرص على عدم تقديم تنازلات التنفس. وحلق في موقع شق جراحي. وتستخدم العصي المسحة Povidine – اليود لغسل المنطقة بين العينين العودة الى المنطقة الواقعة بين الأذنين مع اليود ، والتأكد من اليود لا بالتنقيط في عيني الحيوان. وتعد الخلايا للزرع فقط قبل الجراحة ، وتخلط بشكل دوري للتأكد من أنهم لا تسوية. A 10 ميكرولتر ، يتم تحميل 50 دقيقة الصك الدولي ملم (WPI) ، ساراسوتا ، فلوريدا ، المحاقن مع إبرة قياس 26 مشطوف مع قيحة الخلية. إذا كانت الخلايا يبدو أن تجمعت معا قد يكون من الضروري تحديث المحقنة. ثم يتم وضع الحقنة في 10 ميكرولتر UltraM UMP3 – 1icroPump الدقيقة حاقن (WPI ، ساراسوتا ، فلوريدا). 3. 2 زرع داخل القحف يتم إجراء شق الجلد باستخدام حجم 15 شفرة مشرط وملقط مسنن. يتم إجراء شق طولي من 10-15 ملم بين أعين الحيوان ، والانتقال نحو آذان الحيوان تعريض bregma (تقاطع الخيوط السهمي والإكليلي في الجزء العلوي من الجمجمة). تأكد من تحديد صحيح bregma لأنه يمكن الخلط بسهولة مع منطقة الجيوب الأنفية الذي هو القاصي إلى [الشكل 2] bregma. بعد الحيوان مخدرا يتلقى حقنة داخل incisional من 0.25 ٪ (2.5 ملغ / مل) بوبيفاكايين. ويرصد burrhole 0.1 ملم والخلفي إلى bregma ملم 2.3 إلى يمين خط الوسط عن طريق اللف ببطء قياس 16 بوصة 1 ½ إبرة من جهة ، والضغط قليلا على الإبرة ، بينما التواء حتى اخترق الجمجمة ويتعرض الدماغ. يتم نقل إبرة حقنة أسفل إلى موقف باستخدام الظريف microdrivereotactic حامل حقنة حتى يلمس فقط سطح الدماغ. من هذا الموقف ، متقدمة الإبرة في الدماغ على عمق 3 مم ويوضع في مكان لمدة 3 دقائق. يتم سحب الإبرة 0.4 ملم إلى عمق إجمالي قدره 2.6 مم تحت سطح الدماغ ، وخلق جيب صغير حيث أن الخلايا هي التي غرست. وهو اختياري في هذه المرحلة لالتقاط صورة بالأشعة السينية للإبرة في الحيوان لضمان تحديد المكان المناسب والعمق. هي التي غرست في تعليق خلية أكثر من 3 دقائق باستخدام محقن الدقيقة تعيين إلى حجم NL 2000 (2 ميكرولتر) مع معدل ضخ NL 667 / دقيقة. تبقى الإبرة في مكانها لمدة 2 دقيقة لمنع التسرب من موقع الحقن في الوريد. يتم سحب الإبرة ببطء تماما. يتم تعبئة burrhole بالشمع العظام باستخدام مشرح Penfield. هي خياطة الجرح باستخدام 4-0 (1.5 متري) vicryl خياطة التأكد من عدم ترك أي ثغرات كبيرة في الجلد. Vicryl هي مواد خياطة الجروح التي تذوبق ، وبالتالي الخيوط لا تحتاج إلى إزالتها عند شفى شق. بعد الجراحة يتم وضع الحيوانات في قفص تحت مصباح التدفئة التي تم تعيينها في الارتفاع المطلوب لتسخين السطح السفلي من القفص إلى 30 درجة مئوية. عند الحيوانات مستيقظا بالكامل (كما تقرره حركة طبيعية في قفص) وعادوا إلى السكن المجموعة. يضاف الإيبوبروفين عن طريق الفم لمياه الشرب لمدة 5 أيام بعد الجراحة. يضاف 100 ملغ من الإيبوبروفين الأطفال (100mg/5ml) إلى مستوى 473 مل زجاجة المياه القوارض. ويلاحظ اليومية وتصوير الحيوانات وزنه كل 3 أيام. هو زيادة اسبوعين بعد زرع المراقبة لمرتين في اليوم الواحد. الحيوانات يصرح باستخدامها عندما تظهر علامات تدهور صحة الذي يضم التقوس في الجلوس ، والتنقل ، وتقليل فقدان وزن الجسم المرئي (≥ 20 ٪). هذه الأعراض هي استجابة للورم نشرت وتظهر بتكاثر حوالي 1 يوم قبل وفاة بسبب الورم. 4. وفي فيفو </م التصوير ضوء بارد> 3 بدء [صورة حية] البرمجيات. تتم تهيئة نظام التصوير IVIS بالنقر على [النظام IVIS تهيئة] زر على الجانب الأيمن السفلي من لوحة التحكم. حدد [الانارة] وضع التصوير على الجانب الأيسر العلوي من لوحة التحكم. لتحديد الوقت الأمثل للتصوير بعد الحقن luciferin دراسة الحركية ضروري [الشكل 3]. هذا الوصف هو لluciferase يراعة ؛ حقن 10μl / غرام من وزن الجسم من مد luciferin يراعة (15mg/ml في برنامج تلفزيوني ؛ العلوم الحياتية الفرجار دليل XR – 1001 او منتج مماثل من بائع آخر) في الحيوان ، كما هو موضح أدناه. انتظر 3 دقائق ، ثم تخدير الماوس عن طريق وضعها في غرفة الغاز التخدير (2 ٪ الغاز في Isoflurane O 2). إيقاف التخدير الغاز الى غرفة وفتح صمام التخدير والفراغ إلى مشعب IVIS. المكان فورا الحيوان مخدراعلى منصة التصوير حرارة يتم التحكم فيها ، والتأكد من وضعها بشكل صحيح المنخر الماوس في مشعب الغاز التخدير. ينبغي أن تؤخذ في الصورة الأولى ما يقرب من 5 دقائق بعد الحقن luciferin. ولا يمكن تصوير ما يصل الى 5 الحيوانات في وقت واحد في الصك IVIS الطيف. إذا كان أقل من 5 إلى الحيوانات يمكن تصوير ، فمن الممكن من أجل سد متعددة غير مستخدمة (ق) للحفاظ على الغاز isoflurane. الاستمرار في التقاط صور كل 3 دقائق عن طريق خلق سلسلة لمدة تصل إلى ساعة واحدة لإنشاء منحنى الحركية للتعبير luciferin. انقر على [إعداد تسلسل] زر في لوحة التحكم. المحرر تسلسل تظهر. في لوحة التحكم ، حدد الإعدادات لصورة bioluminescent الأول في التسلسل. نوصي بدءا Binning متوسطة. نوصي أيضا التلقائي التعرض لتحديد الوقت الأمثل التعرض. حدد زر [تأخير] في محرر تسلسلالثانية وتحديد وقت التأخير من 3 دقائق بين كل الاقتناء. فوق [إضافة] في محرر التسلسل. ثم تضاف المعلمات اقتناء الى طاولة المفاوضات. كرر الخطوة 4 لكل صورة في تسلسل. بمجرد إنشاء منحنى ، يمكن تحديد الوقت الأمثل التصوير بواسطة المتهم بالتآمر في قوة الإشارة (الشدة) مقابل الوقت. حيوانات الصور في وقت أعلى المعدلات في العد فوتون فيفو للحصول على إشارة أقوى وأدق. التجارب المبكرة المستخدمة داخل الصفاق (IP) حقن luciferin ، ومع ذلك ، والحقن IP أدت أحيانا إلى نتائج متقطعة تظهر شيئا يذكر لولا تلألؤ بيولوجي في الورم. افترضنا أن عدم إشارة عرضية عشوائية من يرجع إلى تسليم luciferin إلى الأمعاء أو الأحشاء الداخلية الأخرى. ولذلك بدأنا في استخدام تحت الجلد (SC) luciferin الحقن وشهدت أكبر استنساخ التصوير [الشكل 3]. عشرونبعد دقائق من حقن الشوري ، وتخدير الحيوانات عن طريق وضعها في غرفة الغاز مع Isoflurane 2 ٪ في O 2 حتى أنها لا تستجيب. يتم نقل الحيوانات تخدير (ق) إلى غرفة التصوير. وينبغي استخدام مرهم عيني لدراسة الحركية بسبب طول التصوير. ليست هناك حاجة لإجراءات التصوير الأخرى لأنها قصيرة في مدتها. ويتم الحصول على صورة binning المتوسطة مع زمن التعرض 5 دقائق. ويمكن أيضا خيار شراء السيارات المستخدمة. إذا المشبعة الإشارة و / أو خافت على binning المتوسطة ، يمكن تعديلها أو التعرض binning الوقت. يتم حفظ ملفات البرنامج وتعليق على صورة لاحقة في دليل جهاز الكمبيوتر الخاص بالمستخدم. 5. 3D التصوير 3 انقر فوق علامة التبويب [التصوير معالج] في [إعداد تسلسل] نافذة لوحة التحكم. حدد [ضوء بارد] وضع التصوير على الشاشة ومعالج بدء التصوير CLإك [التالي]. في "ضوء بارد — DLIT" نافذة المعالج التصوير ، وحدد مراسل [اليراع] التحقيق. فإن الانبعاثات / الإثارة من الطيف المحدد مصدر يراعة تظهر مع التحديدات six تصفية المقابلة التي سيتم شراؤها. سوف تظهر الشاشة الأخيرة مع الخيارات الافتراضية التي تشمل اقتناء سيارات المعلمات والتعرض للمجال ضبط العرض الافتراضي C. تعمل بشكل جيد جدا ، ولكن يمكن تعديل هذه الإعدادات إذا لزم الأمر. فوق [التالي] وسيتم ملؤها نافذة محرر التسلسل مع سلسلة من ست مناطق طيفية في 20 نانومتر الفلاتر واسعة (560 نانومتر ، 580 نانومتر ، ل 600Nm ، 620 نانومتر ، 640 نانومتر ، و660nm). اضغط [الحصول على تسلسل]. سيكون المرشح الأول (560 نانومتر) تشتمل على نمط منظم باستخدام ضوء الليزر لإنشاء الجلفانومتر تضاريس السطح. حدد [طوبوغرافيا السطح] التبويب في لوحة أداة. ويمكن تطبيق تجانس السطح لحساب أي زوايا حادة نشأت خلال عملية إعادة الإعمار. وينصح تجانس الافتراضي منخفضة. فوق [إنشاء] وسوف يظهر مربع التحليل الطبقي. رسم مربع المحاصيل التي تضم الحيوان بأكمله ثم انقر فوق [التالي]. ستقوم الأداة عتبة تبدو وكأنها قناع الأرجواني على المنطقة المحددة. وينبغي أن يكون تلقائيا قناع تعيين لمطابقة صورة الحيوان. إذا لزم الأمر ، وضبط عتبة قناع لأكثر ملاءمة يتناسب مع الخطوط العريضة لهذا الحيوان. فوق [إنهاء] ، وسوف تظهر شبكة بناؤها. ويمكن بعد ذلك إعادة إعمار يتم حفظها في تبويب النتائج. بعد إنشاء تضاريس سطح الحيوان ، انتقل إلى [إعادة الإعمار 3D DLIT] المنسدلة في لوحة أداة. تحت علامة التبويب [تحليل] تحديد كافة موجات ستة الى تنفيذ اعادة الاعمار. إلغاء تحديد الصور التي أثمرت بكسل المشبعة أو التهم أدناه 600. ترك الإعدادات في التبويب [معلمات] كافتراضي. تحت علامة التبويب [خصائص] يجب أن يتم سرد "العضلات" باعتباره الخيار الافتراضي لليجب أن يتم سرد خصائص الأنسجة ص ، و "اليراع" ، كما الطيف المصدر. فوق [إعادة إعمار] تحت علامة التبويب تحليل ، وإعادة الإعمار 3D من سطح الحيوان وإعادة المقابلة من مصدر إشارة يجب أن يظهر [الشكل 4]. لتحديد موقع وكثافة الإشارة ، حدد زر Voxels في التبويب أدوات 3D لوحة أداة. رسم مربع حول كافة voxels عرض وأظهرت قياسات التدفق الكلي في الجزء السفلي من علامة التبويب الحجم. انقر على [مركز الجماهيري] لتحديد موقع إشارة voxels المحدد. سوف الاكليلية ، وشرائح وعمودي على المحور السهمي للحيوان تظهر وباستخدام [المؤشر قياس عرض] يمكن قياس المسافة من سطح الحيوان للمركز فوكسل. يرجى الرجوع إلى دليل البرنامج صورة العضو المعيشة لمزيد من المعلومات عن التسجيل المشترك للهيئة الأطالس وغيرها من الميزات المتقدمة. 6. البيانات Analysis 3 بعد الحصول على الصورة وحفظها ، والوصول إلى ملف البرنامج بالنقر على زر [استعراض] واختيار الملف. يمكن العثور على المعلومات تحت صورة [عرض] → [معلومات الصورة]. ويمكن قياس كثافة إشارة عن طريق تحديد منطقة (ROI) الفائدة زر [ROI أدوات]. تأكد من تحليل الصور في إطار وضع [فوتون] عن طريق اختيار "فوتون" في القائمة المنسدلة في أعلى الزاوية اليسرى من الصورة لوحة التحكم. حدد زر [قياس العائد على الاستثمار] من القائمة المنسدلة "نوع" قائمة. حدد الشكل عائد الفائدة ، والخيارات تشمل دائرة ، مربع ، وأو الشبكة. تغطية جميع المناطق من الكثافة على الصورة المكتسبة. تم تعيين موقف ROI بسحب اختيار شكل عائدات الاستثمار في المنطقة التي تحتوي على إشارة bioluminescent. يتم حساب كثافة إشارة ROI بالنقر على [قس] زر. التسمية ROI يعرض كثافة. يمكن أن تدار ROI ، وأنقذ USIنانوغرام البرنامج صورة حية. 7. ممثل النتائج : نجاح زرع الخلايا هو واضح عندما يتم اكتشاف خلايا المزروعة باستخدام الطيف IVIS يوم الجراحة. كلا GL261 لوك والخلايا GL261 – luc2 يتم اكتشافها ، ومع ذلك ، فإن الجينات luc2 توفر مستوى أعلى من تلألؤ بيولوجي [الشكل 5]. ربما بعد وقت قصير من الصور التي التقطت لها زرع غير محددة مما يشير على الكفوف الحيوان والأنف الذي ينبغي تجاهل الخلفية. إشارة يقع في موقع انغراس حقيقي وإشارة سوف يزيد مع الوقت [الشكل 6]. انخفاض كثافة إشارة يوم 6 استنساخه ، وعلى الأرجح بسبب فقدان الورم تتخذ من قبل بعض الخلايا المزروعة. قياسات كمية من عبء الورم يتم استنساخه في أنها يجب أن ترتفع باطراد حتى الحيوان يستسلم في النهاية إلى المرض. ومع ذلك ، منحنيات النمو تعتمد إلى حد كبير على الدولة من الخلايا المزروعة ، والتي لا يمكن تجنبها أو فار طفيفة iability في إجراء الزرع. وقد انتخبت لحيوانات المختبر لدينا صورة مزروع كل ثلاثة أيام. الشكل 1 ، وبعد تخدير الماوس بشكل صحيح ، يتم وضعها في الإطار المجسم. يتم تأمين رأس فأر باستخدام المشبك الفم. الشكل 2 ، وبعد فتح الجلد يتم تحديد المعالم الرئيسية تشريحية بما يشمل bregma ، والخيوط الجراحية الاكليلية والسهمي. وأدلى burrhole 2.3mm إلى اليمين من قبل bregma التواء ببطء قياس 16 1 ½ بوصة إبرة مع كمية صغيرة من الضغط حتى يتم اخترق الجمجمة ويتعرض الدماغ. الشكل 3. الحركية للمقارنة تحت الجلد (iles/ftp_upload/3403/3403fig3_1.jpg "بديل =" Figure3.1 "/>) مقابل داخل الصفاق ( أنجز) luciferin حقن للتدليل على فائدة حقنة تحت الجلد وluciferin لتحديد الوقت الأمثل لإدارة الصور luciferin التالية. تم حقن ثلاث دقائق بعد ان كان مخدرا luciferin الماوس ، وضعت في صك الطيف IVIS وتصوير كل 3 دقائق لمدة تصل إلى ساعة واحدة كل 6 دقائق وبعد ذلك لإنشاء منحنى الحركية للتلألؤ بيولوجي. هذا يدل على أن طريق تحت الجلد الإدارة luciferin كانت متفوقة على الحقن داخل الصفاق في أيدينا ، وأن الوقت الأمثل لصورة الحيوانات وكان ما يقرب من 25 دقيقة بعد الحقن luciferin عندما استخدمت GL261 لوك الخلايا. الشكل 4. آراء متعددة من reconst 3 الأبعادخصام من غرس داخل الجمجمة من خلايا GL261 – luc2 المشارك المسجلة لدى الفأر هيكل عظمي والدماغ. الشكل 5. فوتون التهم التي تم الحصول عليها من الأورام الناتجة عن GL261 لوك ​​ضد خلايا GL261 – luc2 الخلايا. النتائج هي في المتوسط ​​من 5 الحيوانات. الشكل 6. رسم بياني لGL261 لوك ​​نمو الخلايا السرطانية في C57BL البيضاء / 6 الماوس. وقد تم قياس تلألؤ بيولوجي كل 3 أيام وخططوا كما هو الحال في عدد الفوتون فيفو مقابل يوما بعد الزرع. تظهر الصور تلألؤ بيولوجي في نقاط زمنية مختلفة. تلون مؤشرا على تلألؤ بيولوجي (كثافة بكسل) التي هي نسبية لعدد الخلايا السرطانية (يظهر شريط الألوان إلى اليمين). بعد الحيوان يستسلم لهذا المرض وتشريح الدماغ وأضيف luciferin موضعيا للحصول على ايماج فيفو السابقينه هو مبين في الشكل أقحم.