Hücresel Self-Meclis Biyomekanik Analizi ve Doku Mühendisliği, Hücre-Türetilmiş Doku Yüzüklerin Üretiyor yönelik
Summary
Bu makalede, hücresel öz-montaj hücre kökenli doku halkaları oluşturmak için çok yönlü bir yöntem özetlemektedir. Düz kas hücreleri içine numaralı seribaşı halka şeklinde agaroz kuyuları agrega ve 7 gün içinde sağlam bir üç boyutlu (3D) dokular oluşturmak için sözleşme. Milimetre ölçekli doku halkaları mekanik test için elverişli ve doku montaj için yapı taşları olarak hizmet.
Abstract
Amerika Birleşik Devletleri'nde her yıl yüzlerce, binlerce hasta koroner arter bypass cerrahisi geçiren bu hastaların 1 yaklaşık üçte biri, hastalığın ilerlemesi ya da bir önceki hasat nedeniyle uygun otolog donör damarları zorunda değilsiniz . Vasküler doku mühendisliği amacı bu bypass greft için uygun bir alternatif kaynak geliştirmek için. Buna ek olarak, vasküler doku mühendisliği, kardiyovasküler hastalıklar çalışmada vasküler modelleri yaşayan gibi değerli ispat edebilir. Hücre tabanlı yöntemler geliştirilmesi ve analizi odaklanan pek çok yeni çalışmalar ile mühendislik kan damarları için bazı umut verici yaklaşımlar incelenmiştir 2-5 Burada, biz hızla kullanılabilir 3D doku halkalar şeklinde kendini monte hücreleri için bir yöntem in vitro vasküler dokuların modeli.
Bunu yapmak için, düz kas hücrelerinin süspansiyonlar yuvarlak dipli halkalı agaroz kuyulara numaralı seribaşı. Agaroz yapışkan olmayan özellikleri inci izine hücreleri uyumlu bir doku halkası oluşturmak için kuyunun merkezinde bir yazı, agrega ve sözleşme yerleşmek için 6,7 Bu halkalar, mekanik, fizyolojik, biyokimyasal ve histolojik inceleme için hasat önce birkaç gün süreyle kültüre olabilir . Biz bu hücre kökenli doku halkaları benzer süreleri (<30 kPa) kültüre diğer doku mühendisliği vasküler yapıları için bildirilen değeri aşıyor 100-500 kPa nihai çekme dayanımı 8 verim olduğunu göstermiştir. 9,10 sonuçları bu sağlam hücre göstermektedir kısa bir süre içinde elde edilen damar dokusu halka nesil ve hücreleri ve vasküler doku yapısı ve işlevi hücre kaynaklı matriks (CDM) katkılarıyla doğrudan ve kantitatif değerlendirilmesi için bir fırsat sunmaktadır.
Protocol
Discussion
Son zamanlarda, hücre tabanlı veya "iskele-az" doku mühendisliği yöntemleri iskele tabanlı doku mühendisliği yaklaşımları bazı sınırlamaları adresi artan bir ilgi olmuştur. Hücre kökenli dokuların hücreleri oluşturulur ve ürettikleri matrisi, onlar doğal olarak çok daha fazla hücre yoğunlukları içeren herhangi bir eksojen maddeler içermez ve tamamen insan hücreleri ve protein yapılabilir olduğunu verilmiştir. Vasküler greftler insan hücrelerinde yapılan eksojen iskeleleri olmaması (örneğin, patlama basınçları insan safen venler için 1600 mmHg göre 3400 mmHg) 12 önemli mekanik gücü elde edebilirsiniz. Vasküler dokularda hücre tabanlı gelişmiş hücre yoğunluğu ve mekanik dayanım, en güncel imalat yöntemleri ("sac-bazlı mühendislik" 3,4,12 veya "bioprinting" 5,13 gibi) gösterir rağmen geniş kültürünün bir süre (> 3 ay) gerektiren veya 3D doku yapımı için özel ekipman. Hücre kökenli doku halka method Burada anlatılan kısa bir süre içinde ve özel ekipman kullanımı olmadan sağlam bir 3D doku yapıları oluşturmak için hızlı hücresel kendini montaj sağlar.
Bu protokol, 2 mm iç çapı sıçan düz kas hücre kaynaklı doku halkaları oluşturmak için geliştirilen prosedürü. Bu örnekte, doku yüzük 7 gün için (daha sonra halka füzyon ve tüp oluşumu için ek bir 7 gün süreyle kültüre) kültüre edildi. Ancak, bir gün sonra hücre tohumlama gibi erken 2 mm sıçan (insan), düz kas hücre halkaları kuyulardan kaldırılır ve (örneğin, silikon tüpler üzerine, transfer) kullanım için yeteri kadar güçlü olabilir. Buna ek olarak, sadece orijinal polikarbonat kalıp sonrası çapı değiştirerek, değişen iç çaplarda (2, 4 ve 6 mm) ile sağlam doku halkalar bu yöntem ile oluşturulabilir. 8 Ayrıca, son beş 2 etkinleştirmek için polikarbonat kalıp tasarımı değiştirilmiş tek bir multi-kuyu agaroz kamara dökme mm tohumlama kuyu,PDMS ve agaroz daha az kullanır ve 6-plaka (veriler gösterilmemiştir) iyi bir sığar. Yazılan çaplı değişiklikler, iyi tohumlama genişlik, yuvarlak alt eğrilik yarıçapı, tohumlama kuyu, ya da tohum kuyuların derinliği sayısı sadece CNC CAD dosyası özellikleri değiştirerek değiştirilebilir. polikarbonat kalıp işleme. Sonunda, tek bir polikarbonat kalıp PDMS şablonları sınırsız sayıda imal etmek için kullanılan, ve her bir PDMS şablon temizlenir, otoklavlanabilir ve onlarca kez yeniden.
Birincil sıçan SMC'lere (Hücre Uygulamaları, R354-05), birincil insan koroner arter SMC'lere (Lonza, CC-2583), birincil insan doku halkalar boyutu değiştirmenin yanı sıra, biz de dahil olmak, pek çok farklı hücre tipleri halkaları yaptık dermal fibroblastlar 11 (Dr George Pins cömert bir hediye, TEFE Biyomedikal Mühendisliği Bölümü), sıçan akciğer fibroblastlar (RFL-6, ATCC CCL-192) ve mezenkimal kök hücreler (Lonza PT-2501). Bu hücre tiplerinin agrega ve doku halkaları oluşturmak için merkezi Mesajları etrafında sözleşmeleri her hücresel organizasyonu, ECM, kompozisyon ve yapıları mekanik özellikleri her hücre tipi için farklı olsa da. Her bir hücre tipi için ekim parametreleri deneysel hücrelerinin büyüklüğü ve yeteneklerini agrega göre tespit edilmelidir. Bu nedenle, hücre kökenli doku halkalar oluşturarak bu sistemi son derece çok yönlü ise, protokol farklı hücre tipleri ile uygun doku oluşumu için ufak ayarlamalar gerekebilir.
Doku halka geometri, açıklandığı gibi, tek eksenli çekme testi ile doku malzeme özellikleri, kolay yükleme ve değerlendirme kolaylaştırır. Damar kasılması ve fizyolojik fonksiyonu ölçmek için kan damarı halkanın kullanmak için önemli bir emsal de yoktur. Hazırlık çalışmaları hücre kökenli doku halkaları farmakolojik yanıt ölçümü için bir tel myograph cihazı monte edilebilir olduğunu gösterir vekasılma kuvveti nesil (veriler gösterilmemiştir). Toplamda, yeteneği, histolojik, mekanik, fizyolojik ve biyokimyasal analiz için hızlı bir şekilde kendi kendine monte hücre halkaları imal sağlığı ve hastalıkları, vasküler doku yapısı ve fonksiyonu modelleme için yararlı olabilecek yeni ve güçlü bir araç göstermektedir.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar minnetle Neil Whitehouse (TEFE, Higgins Makine Atölyesi), CNC işleme ile yaptığı yardım için kabul etmiş sayılırsınız. Ayrıca, biz Camtasia yardım için MATLAB programlama yanı sıra Kate İçecek ve Joseph Cotnoir (TEFE Akademik Teknoloji Merkezi) ile ona yardım için Adriana Hera (TEFE Bilgisayar ve İletişim Merkezi) teşekkür etmek istiyorum. Sophie Burke ve Jacleen Becker (TEFE Akademik Teknoloji Merkezi) tamamlayıcı video görüntüleri sağladı. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü (R15 HL097332), UMass Tıp Fakültesi-TEFE Pilot Araştırma Girişimi, Amerikan Kalp Derneği (JZH Lisans Araştırma Bursu) ve Worcester Politeknik Enstitüsü (JZH ve kurumsal Yaz Lisans Araştırma Bursu tarafından finanse edildi ) MWR fon start-up.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalog # |
|---|---|---|
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 |
| Agarose | Lonza | 50000 |
| DMEM | Mediatech | 15-017-CV |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA | A05-201 |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30-002-CI |
| Digital imaging system | DVT Corporation | Model 630 |
| Uniaxial testing machine | Instron | ElectroPuls E1000 |
| Edge Detection Software | DVT Corporation | Framework 2.4.6 |
References
- Roger, V. L. Heart Disease and Stroke Statistics–2011 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 123, e18-e209 (2011).
- Kelm, J. M. A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks. J. Biotechnol. 148, 46-55 (2010).
- Gauvin, R. A novel single-step self-assembly approach for the fabrication of tissue-engineered vascular constructs. Tissue. Eng. Part. A. 16, 1737-1747 (2010).
- L’Heureux, N., McAllister, T. N., de la Fuente, L. M. Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization. N. Engl. J. Med. 357, 1451-1453 (2007).
- Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting. Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).
- Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries. FASEB. J. 21, 4005-4012 (2007).
- Livoti, C. M., Morgan, J. R. Self-assembly and tissue fusion of toroid-shaped minimal building units. Tissue. Eng. Part. A. 16, 2051-2061 (2010).
- Gwyther, T. Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells. Cell. Tissues. Organs. 194, 13-24 (2011).
- Seliktar, D., Black, R. A., Vito, R. P., Nerem, R. M. Dynamic mechanical conditioning of collagen-gel blood vessel constructs induces remodeling in vitro. Ann. Biomed. Eng. 28, 351-362 (2000).
- Rowe, S. L., Stegemann, J. P. Interpenetrating collagen-fibrin composite matrices with varying protein contents and ratios. Biomacromolecules. 7, 2942-2948 (2006).
- Pins, G. D., Collins-Pavao, M. E., De Water, L. V. a. n., Yarmush, M. L., Morgan, J. R. Plasmin triggers rapid contraction and degradation of fibroblast-populated collagen lattices. J. Invest. Dermatol. 114, 647-653 (2000).
- Konig, G. Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery. Biomaterials. 30, 1542-1550 (2009).
- Mironov, V. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
