Réalisé cellulaire auto-assemblage pour fabriquer des anneaux de tissus dérivés de cellules pour l'analyse biomécanique et génie tissulaire

1. Fabrication de moules cellulaire d'ensemencement Commencez par fraisage d'une 1 / 2 "morceau épais de polycarbonate pour créer 15, à fond rond, puits annulaire avec un diamètre poteau central de 2 mm. Les canaux sont fraisées de 6 mm de profondeur et 3,75 mm de large. Nettoyez et séchez le moule polycarbonate enlever tous les débris de plastique du processus de broyage. Mélanger polydiméthylsiloxane (PDMS) à un ratio 10:1 (p / p) de la base d'agent de durcissement, Degas à supprimer toutes les bulles d'air, et versez sur le moule en polycarbonate. Degas à nouveau pour éliminer les bulles restent, et de guérir dans l'étuve à 60 ° C pendant 4 heures. Une fois durci, retirez soigneusement le modèle PDMS par lentement éplucher loin du polycarbonate, laver avec du savon et de l'eau, et autoclave. Aussi l'autoclave une solution de deux pour cent (p / v) agarose dissous dans le milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM). Placer le gabarit de PDMS sur une surface plane et remplissez avec fondue aga augmenté en commençant par pipetage agarose dans chacun des moules après le centre, puis pipetage dans l'espace autour d'elle. Laisser l'agarose à solidifier (environ 15 minutes), puis inverser le moule pour libérer l'agarose par le PDMS. Couper l'excès d'agarose à travers chacun des puits, et la place des puits d'agarose en plaques de 12 puits. 2. La culture cellulaire et l'ensemencement anneau Ajouter culture cellulaire médias (DMEM avec 10% de FBS et 1% de pénicilline-streptomycine) autour de l'extérieur du moule d'agarose, sans couvrir le haut du moule. Placer les plaques dans l'incubateur et leur permettre de s'équilibrer pendant environ 15 minutes pendant que vous préparez les cellules. À 90% de confluence, les cellules de rats trypsiniser du muscle lisse aortique (FFRS) et remettre à une concentration de 5×10 6 cellules / ml. Pipeter 100 pi de suspension cellulaire dans chaque puits de l'annulaire d'agarose, en utilisant un mouvement circulaire à appliquer aux cellules de chaque puits. contenu »> Assurez-vous que les étagères sont incubateur niveau, puis placer les plaques dans l'incubateur et à leur permettre de s'asseoir tranquille pendant 24 heures. média d'échange tous les deux jours suivants, en aspirant les médias de partout dans le bien, et re-remplissage de chaque bien jusqu'à la agarose est bien complètement submergé. 3. La récolte anneau de tissus et de mesures d'épaisseur A l'issue de la culture, retirer l'anneau du moule d'agarose en le faisant glisser sur le dessus de la poste centrale. Placez l'anneau dans une petite boîte de Petri avec un tampon phosphate salin (PBS), centre de l'échantillon, et d'acquérir une image en utilisant un système d'imagerie numérique. Utilisez un programme d'analyse d'image pour la détection de contours et de mesurer l'épaisseur de l'anneau en 4 positions (haut, bas, gauche et droite) autour de sa circonférence. Calculer la valeur de l'épaisseur moyenne (t) pour chaque anneau individuel, et utiliser cette valeur pour calculer la surface de section transversale(2π (t / 2) 2). 4. Essais mécaniques des anneaux Mettre en place la machine de traction (Instron EPS 1000) dans la position horizontale. Fixer une cellule de charge ± 1N 1mn et personnalisés poignées mince fil de fer (créée par la flexion fil d'acier inoxydable). Mont de l'échantillon anneau sur les deux poignées de fil mince. Étendre les poignées jusqu'à ce qu'un 5 mN tare charge est appliquée à l'échantillon. Entrez dans la zone transversale (calculé à partir des mesures d'épaisseur) et d'enregistrer la longueur du calibre. Pré-cycle de l'anneaux 8 fois entre la charge de tare et 50 kPa de stress à un taux de 10 mm / min. Après le huitième cycle de pré-, tirer à l'échec à 10 mm / min. L'échec est noté comme une diminution de la force par 40% d'une mesure à l'autre. Pour chaque échantillon, anneau, de mesurer la contrainte de traction (UTS) et déformation à la rupture et de calculer le module tangent maximum (MTM) à partir des données acquises. 5. Anneau de tissu commesemblée pour fabriquer des tubes de tissu Porte-tubes personnalisés sont usinées à partir de 5 disques ronds en polycarbonate cm avec découpes rectangulaires (2 cm x 3 cm). Percez des trous filetés à travers ces disques pour permettre à deux détenteurs d'être vissés ensemble. Autoclaver les porte-tubes personnalisés, puis transfert à l'enceinte de sécurité biologique et les placer dans un plat de Petri vides. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper les extrémités des tubes de 1,9 mm de diamètre en silicone à un angle de créer des bords biseautés, puis l'autoclave les tubes de silicone. Alors que les tubes sont autoclavés, remplir une boîte de Pétri avec les médias. Retirer les bagues dans les puits d'agarose et les placer dans la boîte de Pétri avec les médias. Placer l'autoclave tubes de silicone dans le même plat de Pétri pour les mouiller avant de l'utiliser. Utilisez une pince pour placer une extrémité biseautée d'un tube de silicone dans le centre d'un anneau et faites glisser doucement l'anneau sur le tube de silicone. Répéter avec le nombre souhaité de riNGS. Faites glisser les anneaux en contact avec eux par les poussant délicatement successivement dans les deux directions le long du tube. Cette méthode peut être utilisée pour les anneaux récoltés après une seule journée dans la culture. Une fois que les anneaux sont montés, d'aligner les tubes de silicone dans les porteurs de polycarbonate et visser les deux parties du titulaire ensemble. Placez le support dans un plat de Pétri de 100 mm et ajouter 55 ml de milieu. Échange des médias tous les 3 jours pour la durée de la culture. Pour enlever les tubes des tissus, des tubes de silicone communiqué du détenteur de polycarbonate et de l'utilisation des forceps pour faire glisser le tube de tissu hors du tube de silicone et dans une boîte de Petri remplie de PBS. 6. Les résultats représentatifs: Lorsque le protocole est réalisé correctement, les cellules s'agrègent pour former des anneaux de tissu avec un diamètre intérieur égal au diamètre du moule correspondant au poste dans les 24 heures. Les bords anneau sont habituellement lisses en apparence et (si la cultured sur une surface plane), sont d'épaisseur uniforme sur toute la circonférence. Les anneaux de tissu sont faciles à manipuler et peut être démis de leurs puits pour l'analyse mécanique et histologiques ultérieures (voir en Gwyther et al., 2011 8). Morphologie anneau de tissus, composition de la matrice, et les propriétés mécaniques varient selon le nombre et le type de cellules ensemencées. Les résultats représentatifs à partir des anneaux de tissu fabriqué à partir divers types de cellules, l'ensemencement des conditions, et la longueur de la culture sont présentés au tableau 1. Deux anneaux mm ID créé à partir de 5×10 5 FFRS présentaient une UTS supérieur anneaux créés à partir de notre publiés antérieurement 2 anneaux mm (fabriqués à partir de 5 6.6×10 FFRS). Similaire à 8 cellules de rat, cellules musculaires lisses humaines (HSMC) facilement agrégées pour former des tissus anneaux, qui contenait une grande quantité de collagène après seulement 14 jours de culture (données non présentées). Les cellules souches mésenchymateuses (hMSC) également regroupées et forment des anneaux cohérent, mais lala force mécanique et cked brisé pendant les phases initiales de test précyclage traction uniaxiale. n Le nombre de cellules Epaisseur (mm) Longueur de la culture (jours) UTS (kPa) MTM (kPa) Déformation à la rupture (mm / mm) anneaux FFRS 6 660000 0,94 ± 0,12 14 97 ± 30 497 ± 91 0,50 ± 0,08 anneaux FFRS 4 500000 0,53 ± 0,02 7 113 ± 8 189 ± 15 0,88 ± 0,05 anneaux HSMC 3 750000 0,51 ± 0,05 14 160 ± 30 270 ± 20 0,92 ± 0,08 anneaux hMSC 3 750000 0,40 ± 0,07 14 N / A N / A N / A Tableau 1. Tableau montrant les paramètres de la culture et des propriétés mécaniques de deux anneaux mm générées par différents types cellulaires, les concentrations de l'ensemencement, la culture et des durées. Figure 1. (A) Schéma du processus de génération des tissus anneau. (B) personnalisé en polycarbonate moule avec fraisé puits annulaire. Diamètres de poste central sont de 2 mm. (C) modèle de PDMS après qu'il a été décollé du moule en polycarbonate. (D) anneau de tissus cultivés agrégées dans un moule d'agarose avec un poste de 2 mm. (E) mm Deux anneaux de tissu de diamètre dans du PBS. Barres d'échelle = mm 6 mm (B, C) et 2 (D, E). Figure 2. Tracé représentatif de la courbe contrainte-déformation producteursced des essais de traction uniaxiale.