Rekombinant Adeno ilişkili Viral Vektörlerin Üretimi ve Titering

Aşağıdaki protokol özetleyen bir örnek için Şekil 1'e bakınız. Emniyet Not: monte viral parçacıkların temas halinde olan tüm malzeme Virkon ® çözümü ya da diğer uygun bir dezenfektan ile dezenfekte edilmesi gerekir. 1. Plazmid DNA stoklarının hazırlanması (~ 2 gün) Aşağıdaki plazmid 1 gereklidir: pRV1 – AAV2 Tecrübe ve kap dizileri İçeren pH21 – AAV1 Tecrübe ve kap dizileri içeren pFdelta6 – Adenovirüs yardımcı plazmid AAV2 ambalaj sinyalleri (ters terminali tekrarlar, ITRs) ile çevrili rekombinant ifade kaset içeren plazmid AAV PFdelta6 kısmi silinmesini önlemek için Stbl2 yetkili hücrelerde yetişen olmalıdır, pRV1 ve pH21 DH5alpha yetkili hücreleri yetiştirilebilir. AAV plazmid kısmi silmeler DH5alpha hücrelerinde meydana gelmesi halinde Stbl2 hücreleri yetiştirilebilir. Plazmid DNA yüksek kaliteli ve RNA yabancı maddelerden arındırılmış olmalıdır. Plazmidler bütünlüğü için aşağıdaki digests kullanarak taranabilen: pRV1 – Özet XbaI ile 7.5 kb ve 3.8 kb bantları vermek pH21 – sindirmek EcoRI ile 4.5 kb bant, 2.8 kb ve 0.2 kb vermek pFdelta6 – HindIII ile sindirimi 5.5 kb bant, 3 kb, 3 kb, 2.3 kb ve 1.5 kb vermek 2. (3 gün 2) transfeksiyon İnsan Embriyonik Böbrek 293 (Hek293) hücreleri hazırlanması Tabak iki adet 80% konfluent 150 cm 2 şişeler içine Hek293 hücreleri beş 15 cm çapında Nunc doku kültürü yemekleri. Hücreler 70 -% 80 (yaklaşık 48 saat sonra kaplama) transfeksiyon önce konfluent. % 10 fetal buzağı serumu ve 100 U / ml penisilin / 100 mikrogram / ml streptomisin içeren düşük glikoz ile standart Dulbecco'nun modifiye Eagle orta (DMEM) Kültür hücreleri. 3 saat önce transfeksiyon DMEM kaldırın ve Iscove değiştirin'Ler modifiye Dulbecco'nun orta (IMDM) fetal buzağı serumu,% 5 içeren. 3. Viral plazmid Transfeksiyon (transfeksiyon ~ 1 saat, 3 gün inkübasyon) (5 x 15 cm doku kültürü plakaları) virüsü tek bir toplu iş için aşağıdaki hazırlayın: Plazmid 62.5 mikrogram AAV 125 mg pFdelta6 31.25 mg pRV1 31.25 mg pH21 1650 ul 2.5 M CaCl 2 12 ml dH 2 O 50 ml'lik bir tüp içine sınıfı 2 doku kültürü kaput steril filtre transfeksiyon karışımı. Çözüm vorteks olsa da, hızlı bir şekilde 13 ml 2 x Hepes tamponlu salin (pH 7.05). 50 ml tüp kapağını değiştirin ve 15 saniye boyunca girdap devam. 1 dakika 45 saniye bekletilir, ince beyaz bir çökelti oluşturması gerekir. , Yavaşça, her biri 15 cm doku kültürü çanak transfeksiyon çözüm 5 ml ekleyin. Swirl plakaları karıştırın ve inkübatör dönmek. 16 saat sonra transfeksiyon IMDM orta kaldırmak ve DMEM ile değiştirin. 4. (2 saat) hücreleri, Parçalama ve rAAVs hasadı Transfeksiyon 72 saat sonra, hücre kültürü plakaları, ortamı çıkarın ve atın. Tüm atık Virkon ® çözümü ya da diğer uygun bir dezenfektan ile tedavi edilmelidir. Hücreler yavaşça sıcak 1x fosfat yıkama tamponlu salin (PBS, pH 7.4). Her plaka için 25 ml sıcak PBS ekleyin ve bir hücre kazıyıcı ile hücreler yavaşça çıkarın. 50 ml tüpler süspansiyon toplayın. 10 dakika boyunca 800 xg'de Pelet hücreleri. NaCl 150 mM, 20 mM Tris, pH 8.0 süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet atın, doku kültürü plaka başına 10 ml kullanın. Iki adet 50 ml tüpler böler. DH 2 O% 10 sodyum deoksikolatın taze bir çözüm hazırlayın Bu 1.25 ml,% 0.5 'lik son konsantrasyon için her tüp ekleyin. Ml başına 50 adet nihai konsantrasyonu Benzonase nükleaz ekleyin. Tüp iyice karıştırın. <l> 37 ° ° C'de 1 saat süreyle. 15 dakika boyunca 3000 xg santrifüj hücresel enkaz çıkarın. Taze 50 ml tüp geçiş, tüm hücre enkaz (Adım 5'e bakınız), heparin sütun engellenmesini önlemek için çıkarıldığından emin olun. Bu aşamada devam etmeden önce, numuneler -20 ° C'de saklanabilir. Biz enfektivite bir azalma olmadan örnekleri -20 ° C'de birkaç hafta boyunca saklanan var. 5. Heparin sütun rAAVs, arıtma (2 – 3 saat) Çözümler akış, 5.2 – 5.4 için gerekli adımları dakikada 1 ml sütun ile peristaltik bir pompa kullanarak Kur HiTrap heparin sütun. Hiç hava kabarcığı heparin sütuna tanıtıldı sağlamak için önemlidir. 10 ml 150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0 ile sütun dengelenmesi. 50 ml virüs çözümü için sütun uygulayın ve akmasına izin verin. 20 ml 100 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0 ile sütun yıkayın. 5 ml şırınga kullanarak sütun w yıkama devam1 ml 300 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0 ile takip ITH 1 ml 200 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0,. Flow-through atın. Uygulayarak sütun 5 ml şırınga ve hafif basınç Zehir virüs kullanma: 1.5 mL 400 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0 3,0 ml 450 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0 1.5 mL 500 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0 15 ml santrifüj tüpüne bu toplayın. 6. Konsantrasyon ve rAAVs steril filtrasyonu (1 saat) 100.000 molekül ağırlığı kesme Amicon ultra-4 santrifüj filtre üniteleri kullanarak vektör Konsantre. 2 dakika için 2000 xg (oda sıcaklığında) 4 ml sütun eluat konsantratör ve santrifüj içine yükleyin. Kalan virüs çözümü ve tekrar santrifüj flowthrough ve yeniden konsantratör atın. Konsantre hacmi yaklaşık 250 ul olmalıdır. Konsantre hacmi göre anlamlı derecede daha fazla ise, akış t iptalaşma ve bir dakikalık adımlarla hacmi yaklaşık 250 ul kadar santrifüj devam etmektedir. PBS 250 ul 500 ul son bir hacim için virüs ve konsantratör kaldırmak. 13 mm çapı 0,2 mikron şırınga filtresi süzülür vektör. Vektör ° C 'ye kadar gerekli -80 aliquoted ve saklanan olmalıdır. 7. Viral stoklarının Titering (3 gün) Bu, bir muhabir gen ya da immunocytochemically saptanabilir bir gen ürünü sürüş Hek293 hücreleri aktif bir organizatörü gerektirir. Hek293 hücreleri diğer hücre hatları veya primer hücre kültürleri ile uyumlu değildir üreten bir vektör. % 50 confluent – 40 böylece Hek293 hücrelerin ekim tarafından 18 poli-L-lisin kaplı cam lamelleri ya da 18 kuyu Nunc oda slaytlar hazırlayın. Kre-bağımlı rAAVs titrasyonu için, stabil bir şekilde ifade Cre recombinase 2 Hek293 hücreleri kullanır. Seri d her iyi enfekteAAV vektör (Şekil 2A) ilutions. Başına 3 kuyu seyreltme kullanın. Biz rutin olarak her bir kuyu için doğrudan virüs eklemek. 72 saat on dakika oda sıcaklığında (son konsantrasyon% 2 PFA veren) orta,% 4 paraformaldehid bir eşit hacimde (PFA) ekleyerek Hek293 hücreleri düzelttikten sonra. DH 2 O ve kapak hücre PBS içinde üç kez yıkayın, durulayın. Seyreltme faktörü yüksek olan üç kuyu, transduced hücrelerinin sayısını ancak hala enfekte olan hücreleri içeren bu ortalama ve mikrolitrelik başına enfeksiyöz birim (Şekil 2B) sayı vermek seyreltme faktörü ile çarpın. 8. Beklenen Sonuçlar Hek293 hücreleri gelişmiş yeşil flüoresan protein (eGFP) Şekil 2B gösterilen bir virüs kodlama ile transduced. Biz genellikle mikro litre başına yaklaşık 6 x 10 6 enfeksiyöz partiküller tutarlı titreleri elde. Biz rutin stereotaksik inje için bu vektörleryetişkin kemirgen beyin içine ction. Bu bölgeye özgü gen ekspresyonu 2 için güçlü bir teknik sağlar. Kre-transgenik fareler 2 hedef bölgeye Cre recombinase bağımlı rAAVs enjekte hücre tipi seçici gen ekspresyonu ile bu bölgede özgüllük birleştirmek için. Şekil 2C-E yetişkin parvalbumin-Cre transgenik farelerin 3 farklı beyin bölgeleri içine eGFP kodlama Cre bağımlı rAAVs stereotaksik enjeksiyonları örnekler gösterir. Şekil 1 rAAV üretimi için protokol şematik gösterimi. 1) Hek293 hücre kaplama ve 70 büyüdü – 80% izdiham. 2.) AAV ve yardımcı plazmid hazırlanan ve Hek293 hücre içine transfekte. 3.) Orta transfeksiyon sonra DMEM 16 saat geri ve Hek293 hücreler 56 saat başka bir kültüre. 4.) Hek293 hücre hasat ve parçalanmış olan. c rAAV vektörlerin hücre enkaz ayrılırentrifugation. 5.) Viral partiküller konsantrasyon ve sterilizasyon önce heparin sütunları ile temizlenir. 6) Hek293 hücreleri 24 kuyucuğu büyüdü ve bulaşıcı birimlerinin sayısını belirlemek için AAV vektör seri dilüsyonları ile enfekte. Şekil 2 Titering ve rAAV1 / 2 in vivo uygulama. Viral titresi ölçmek için Hek293 hücreleri (A) Kurulum. RAAVs seri dilüsyonları ile Hek293 hücreleri transduced. C, enfekte olmamış kontrolü; N, sulandırılmamış viral stokunun 1 ul. (B) Hek293 hücreleri eGFP ifade rAAVs etkilemiştir. (CE) Viral eGFP ifade sınırlıdır Cre ifade Cre-aktif rAAVs stereotaksik enjeksiyondan sonra parvalbumin-Cre transgenik farelerin farklı hedef bölgelerdeki nöronlar. Örnekler görüntüleri (C) retiküler talamus ve globus pallidus GFP immünoreaktivite, (D) dentat girus ve hipokampus (E) CA1 bölge. DG, DEntate girus, RT, retiküler talamik nükleus, GP, globus pallidus. Ölçek barlar: B, 500 mm; C, 100 mm; D, 100 mm; E, 500 mm.