Multiplex Nachweis von Bakterien in komplexen Clinical and Environmental Proben mit Oligonukleotid-gekoppelten Fluoreszenz-Mikrosphären
Summary
Wir beschreiben ein Multiplex-Verfahren für den Nachweis von Mikroorganismen in einer Probe mit Oligonukleotid-gekoppelte fluoreszierende Kügelchen. Amplicon aus allen Organismen in einer Probe ist es, ein Gremium von Sonde-gekoppelten Beads hybridisiert. Ein Luminex oder Bio-Plex Gerät wird verwendet, um jede Perle für Perle Art und Hybridisierungssignal Abfrage.
Abstract
Bakterielle Vaginose (BV) ist ein immer wiederkehrendes polymikrobiellen Syndrom, das durch einen Wechsel in die "normale" Mikroflora von einer Mikroflora durch eine Reihe von Bakterienarten, darunter Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae dominiert Lactobacillus-dominiert, und andere 1-3 charakterisiert ist. Dieser Zustand ist mit einer Reihe von negativen gesundheitlichen Folgen, einschließlich HIV Erwerb 4 zugeordnet, und es kann schwierig sein, klinisch 5 zu verwalten. Darüber hinaus hat Diagnose der BV über die Verwendung der Gramfärbung von vaginalen Abstrich Abstriche, die auf verschiedenen numerischen Kriterien 6,7 erzielt wird, sind verlassen. Während diese Diagnose ist einfach, kostengünstig und gut geeignet, um mit beschränkten Ressourcen, kann er von Problemen im Zusammenhang mit subjektiven Interpretationen und es gibt nicht ein detailliertes Profil der Zusammensetzung der vaginalen Mikroflora 8 leiden. Aktuelle deep sequencing Bemühungen haben eine reiche, vielfältige vaginale Mikroflora mit der geoffenbartendeutliche Unterschiede zwischen den Proben von Personen, die mit BV im Vergleich zu denjenigen Personen, die als normal 9,10 sind, die bei der Identifizierung einer Reihe von potenziellen Zielen für die molekulare Diagnostik der BV 11,12 geführt hat diagnostiziert werden übernommen. Diese Studien haben eine Fülle von nützlichen Informationen zur Verfügung gestellt, aber tief-Sequenzierung ist noch nicht praktisch wie ein diagnostisches Verfahren in einer klinischen Umgebung. Wir haben vor kurzem ein Verfahren zur schnellen Profilierung der vaginalen Mikroflora in einem Multiplex-Format Verwendung von Oligonukleotid-gekoppelte fluoreszierende Kügelchen mit Erkennung auf einem Luminex-Plattform 13 beschrieben. Diese Methode, wie aktuelle Gramfärbung-basierte Methoden, ist eine schnelle und einfache, aber fügt den zusätzlichen Vorteil der Nutzung molekularer Erkenntnisse aus der Sequenzierung Studien in Sonde Design. Diese Methode bietet daher eine Möglichkeit, die wichtigsten Mikroorganismen, die in einer vaginalen Abstrich, mit dem BV mit hoher Spezifität und Sensitivität comp diagnostizieren können, werden ProfileARED auf Gram-Färbung, während die Bereitstellung zusätzlicher Informationen über die Arten Präsenz und Fülle in einem semi-quantitative und schnelle Weise. Das Multiplex-Verfahren ist erweiterbar und über den Bereich der aktuellen quantitative PCR-Assays für bestimmte Organismen, die derzeit auf 5 oder 6 verschiedene Tests in einer einzigen Probe 14 ist begrenzt. Wichtig ist, dass das Verfahren nicht auf den Nachweis von Bakterien in Vaginaltupfer begrenzt und kann leicht angepasst werden, um schnell Profil nahezu jede mikrobielle Gemeinschaft von Interesse. Zum Beispiel haben wir vor kurzem damit begonnen, diese Methode auf die Entwicklung von Diagnose-Tools gelten für den Einsatz in Kläranlagen.
Protocol
Discussion
Die Spezifität des Signals Generation von entscheidender Bedeutung ist, Sie müssen sicher sein, dass das Signal beobachtet reflektiert wirklich den Nachweis von Amplikon aus diesem Organismus erzeugt. Software wie PrimerPlex (Premier Biosoft) kann helfen, Sonden, die effizient hybridisieren Design, aber sie kann oder auch nicht, um Nicht-Zielarten cross-Hybridisierung. Als universelle PCR-Primer verwendet werden, wie in diesem Protokoll beschrieben, ist es wichtig zu bedenken, dass das Amplifikat generiert alle Organi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Alberto Severini und Vanessa Goleski um Hilfe bei der Assay-Entwicklung und kritische Kommentare zu diesem Manuskript. Diese Arbeit wurde von der Public Health Agency of Kanada und der Industrial Research Assistance Program (National Research Council in Kanada) finanziert. Zusätzliche Unterstützung wurde von der University of Saskatchewan Publication Fund erhalten.
Materials
| Oligonucleotide name | Company | Sequence1 |
| H279BP | Invitrogen, IDT, or other | Biotin-OEFOGAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC |
| H280 | YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT | |
| H1612BP | Biotin-OEFOGAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC | |
| H1613 | CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT | |
| 1O, phosphorothioate-C; E, phosphorothioate-G; F, phosphorothioate-A; I, inosine; Y, C or T; R, A or G; K, T or G; S, C or G. | ||
Table 1. Sequences of the modified oligonucleotides for universal cpn60 PCR.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC) | Pierce | 22980 | |
| Fluorescent polystyrene beads: MicroPlex Microspheres (Luminex), or Bio-Plex COOH Bead (Bio-Rad) | Luminex or Bio-Rad | Bio-Rad: 171-506xxx where xxx corresponds to the bead identifier | Magnetic beads are becoming available for oligonucleotide coupling and may offer certain advantages. Have not been tried by these authors. |
| Capture oligonucleotides (5′ amino C12 modified) | Invitrogen, IDT, or other | various | Desalted purity level is acceptable. Sequences of the capture probes used to characterize vaginal swabs are provided in the manuscript on which this protocol is based13. |
| T7 exonuclease | New England Biolabs | M0263S | |
| Streptavidin-R-phycoerythrin (SA-PE) | Invitrogen | S-866 | Be careful to obtain high purity SA-PE; this catalog number is recommended |
| Thermowell 96 well PCR plates | Fisher | CS006509 | fit into both 96-well thermocycler and BioPlex machine |
| Thermowell sealing mat | Fisher | CS006555 | Can be re-used; wash with soapy water, rinse well, and dry |
| 5M TMAC | Sigma | T3411 | |
| Bio-Plex or Luminex instrument | Bio-Rad or Luminex | Bio-Rad : 171-000201 | |
| PrimerPlex software for probe design | Premier Biosoft | www.premierbiosoft.com | Suggested for Luminex probe design, although other software platforms may be used |
Table 2. Specific reagents and equipment.
| component | μl/assay | μl/100 assays | final concentration |
| 10x PCR buffer (Invitrogen) | 5 | 500 | 1x |
| 50 mM MgCl2 (Invitrogen) | 2.5 | 250 | 2.5 mM |
| 10 mM dNTP | 1 | 100 | 0.2 mM each |
| H279BP, 25 μM | 0.25 | 25 | 375 nM |
| H1612BP, 25 μM | 0.75 | 75 | 125 nM |
| H280, 25 μM | 0.25 | 25 | 375 nM |
| H1613, 25 μM | 0.75 | 75 | 125 nM |
| Water | 34 | 3400 | — |
| Totals | 44.5 | 4450 |
Table 3. Suggested mixtures for PCR with modified cpn60 UT primers (Table 1). The assay is set up for 5 μl of template DNA and 0.5 μl (2.5U) of Taq DNA polymerase (Invitrogen). Normally large volumes are prepared (e.g. sufficient for 100 assays) and stored at -20°C.
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